A Long Non-coding RNA ，LncMyoD ，Regulates SKeletal Muscle Differentiation by Blocking IMP2-Mediated mRNA Translation

日期：2017-07-15 標簽：LncMyoD

mRNA翻譯調控研究案例（一）

（一）調控通路圖：

    MyoD結合到LncRNA MyoD啟動(dòng)子上促進(jìn)LncRNA MyoD的表達，然后LncRNA MyoD通過(guò)與mRNA結合蛋白IMP2結合，使其不能結合到mRNA上，從而抑制mRNA的翻譯。

（二）實(shí)驗流程：

作者首先通過(guò)分化的骨骼肌細胞和未分化細胞的RNA-seq分析篩選出LncRNA MyoD,然后進(jìn)行q-pcr驗證在肌小管細胞中LncMyoD高表達。隨后對LncMyoD進(jìn)行功能實(shí)驗和調控機制研究。

LncMyoD功能研究：首先建立LncMyoD過(guò)表達/敲低穩定細胞株，檢測過(guò)表達/敲低后的與細胞分化相關(guān)基因的表達以及細胞增殖分化檢測。

調控機制研究：（1）蛋白MyoD與LncMyoD啟動(dòng)子結合促進(jìn)LncMyoD表達，作者用CHIP和啟動(dòng)子熒光素酶實(shí)驗檢測兩者的關(guān)系。（2）LncMyoD結合Mrna結合蛋白IMP2抑制靶標mRNA表達：先用RNA pull-down和RIP驗證LncMyoD與IMP2結合，然后對LncMyoD敲低后的細胞分別用QRT-PCR和WB檢測靶標mRNA和蛋白的表達，用IMP2抗體在不同培養時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行RIP實(shí)驗檢測結合的RNA，表明LncMyoD與IMP2靶標mRNA競爭結合IMP2。

（三）核心FIGURE：

Figure1說(shuō)明的是MyoD蛋白結合的LncMyoD的啟動(dòng)子上并促進(jìn)LncMyoD的表達。

A、通過(guò)MyoD蛋白的過(guò)表達和敲低，用 qRT-PCR檢測LncMyoD的表達情況。表明MyoD促進(jìn)LncRNA MyoD的表達。

B、通過(guò)熒光素酶驗證LncMyoD啟動(dòng)子受MyoD的誘導激活下游基因的轉錄。

C、CHIP實(shí)驗，用蛋白MyoD抗體釣取與MyoD結合的DNA片段，聯(lián)用Q-PCR檢測蛋白與LncMyoD啟動(dòng)子的結合區域。結果表明MyoD結合到LncRNA MyoD啟動(dòng)子的Primer1和Primer4區域。

Figure2說(shuō)明的是LncMyoD與IMP2靶標mRNA競爭結合IMP2從而降低這些靶標基因的表達。

A、 RNA pull-down，用LncMyoD探針釣取與LncMyoD結合的蛋白，用IMP2抗體進(jìn)行WB驗證LncMyoD與蛋白IMP2結合。

B、 RIP用IMP2抗體從LncMyoD敲低和未敲低細胞中釣取與IMP2結合的RNA，用Q-PCR檢測RIP產(chǎn)物，結果表明LncMyoD敲低后與IMP2結合下降。

C、 RIP，用IMP2抗體從LncMyoD敲低和未敲低細胞中釣取與IMP2結合的RNA，用Q-PCR檢測產(chǎn)物中的IMP2靶標mRNA，結果表明LncMyoD敲低后，IMP2與其靶標Mrna的結合上升。

D、 RIP，用IMP2抗體在不同時(shí)間點(diǎn)從細胞中釣取與IMP2結合的RNA，然后檢測產(chǎn)物中的相關(guān)RNA，表明LncMyoD與IMP2靶標mRNA競爭結合IMP2。

本公司可提供的技術(shù)服務(wù)項目

本公司可進(jìn)行類(lèi)似實(shí)驗的實(shí)驗設計及整體實(shí)驗外包項目，包括Q-PCR、慢病毒穩轉株的建立（過(guò)表達/敲低）、Luciferase檢測、CHIP、RNA pull-down、WB、RIP，其中Luciferase檢測、CHIP、RNA pull-down、RIP為本公司主營(yíng)項目。

一、Luciferase檢測：檢測轉錄因子和其靶啟動(dòng)子中的特異序列結合的重要手段

本實(shí)驗用MyoD蛋白表達質(zhì)粒和LncMyoD啟動(dòng)子熒光素酶報告質(zhì)粒轉染細胞檢測啟動(dòng)子活性，實(shí)驗結果表明隨著(zhù)MyoD表達升高LncMyoD啟動(dòng)子活性增強，說(shuō)明了MyoD對LncMyoD啟動(dòng)子的激活。證明了MyoD對LncMyoD啟動(dòng)子的激活作用。

二、CHIP技術(shù)：主要研究蛋白與RNA的相互作用

本實(shí)驗驗證了LncMyoD啟動(dòng)子與MyoD結合的區域。用MyoD抗體進(jìn)行CHIP獲取與MyoD蛋白結合的DNA片段，然后用LncMyoD啟動(dòng)子不同區段的引物進(jìn)行Q-PCR檢測，說(shuō)明了LncMyoD啟動(dòng)子與MyoD結合的區域在P1和P1區域。

三、RNA pull-down：檢測RNA結合蛋白與其靶RNA之間相互作用的主要實(shí)驗手段之一。

       本實(shí)驗用LncMyoD探針釣取與RNA結合的蛋白，然后對產(chǎn)物進(jìn)行WB驗證，說(shuō)明了LncMyoD與IMP2的結合關(guān)系。我公司在實(shí)驗體系中同時(shí)提供lncRNA正義鏈與反義鏈的pull down。

四、RIP技術(shù)：主要研究蛋白與RNA的相互作用

   用IMP2抗體進(jìn)行RIP實(shí)驗獲取不同時(shí)期與IMP2結合的RNA，然后進(jìn)行Q-PCR檢測產(chǎn)物中的RNA，隨時(shí)間推移與IMP2結合的LncMyoD呈上升趨勢，而IMP2的靶標mRNA結合越來(lái)越少，說(shuō)明了LncMyoD競爭性的結合IMP2是IMP2不能結合到靶標mRNA上。

參考文獻：Chenguang Gong, Zhizhong Li, Krishnan Ramanujan，et al.A Long Non-coding RNA, LncMyoD, Regulates Skeletal Muscle Differentiation by Blocking IMP2-Mediated mRNA Translation［J］. Developmental Cell,2015,34, 181–191