技術(shù)服務(wù)描述

染色質(zhì)免疫共沉淀測序 RIP-Seq 結題報告

生信部

2020年08月25日

項目信息

合同編號：XXX-2020-01-01-01

客戶(hù)姓名：XXX

客戶(hù)單位：X X X X X X

1. 工作流程

RNA免疫共沉淀（RIP）是一種用于研究蛋白質(zhì)與 RNA 的體內相互作用的經(jīng)典實(shí)驗技術(shù)。采用特異性抗體將目的蛋白進(jìn)行免疫沉淀，由此可以把目的蛋白所結合的RNA片段也富集下來(lái)。通過(guò)與高通量測序技術(shù)的結合，對 RIP 后的RNA 產(chǎn)物進(jìn)行測序分析， 從全基因組范圍內尋找目的蛋白的 RNA 結合位點(diǎn)，以高效率的測序手段得到高通量的數據結果。

1.1. RIP 免疫沉淀實(shí)驗流程

目前主要有兩種不同的RIP 實(shí)驗方法，大致流程如下（以細胞樣品的處理過(guò)程為例）：

RNA Immunoprecipitation

1. 準備足量的新鮮細胞，每個(gè)IP約1x107個(gè)細胞，用RIP裂解液裂解細胞

2. 加入2-5ug抗體，抗體與蛋白，4℃孵育過(guò)夜

3. 加入proteinA/G磁珠，4℃孵育4-6小時(shí)

4. 清洗磁珠。

5. Proteinase K 解交連。

6. 酚氯仿或RNA提取試劑盒提取RNA

7. QPCR 檢測或建庫測序

1.2. RIP Sequencing 文庫構建流程

1. 用qubit 及2100對RIP片段進(jìn)行定量及片段長(cháng)度檢測

2. 加入適當的Mg2+,加熱打斷RNA片段

3. 加入反轉錄酶，反轉錄成cDNA

4. 斷裂RNA鏈且以斷裂RNA為引物，cDNA為模版，形成雙鏈DNA

5. 補齊片段末端，并在3’末端加A尾

6. 添加Adapter

7. 0.8X AMPure beads去掉多余的Adapter

8. 文庫PCR擴增

9. 1XAMPure beads 去掉多余的primer

10. qPCR測定文庫濃度

11. Agilent 2100測定文庫片段大小

1.3. 生物信息分析流程

將測序結果與參考基因組比對，比對上唯一位置的序列用于后續標準信息分析及個(gè)性化分析。信息分析流程如下：

2. 生物信息分析

2.1. RIP Sequencing 文庫質(zhì)檢結果

文庫片段質(zhì)檢，RIP文庫的染色質(zhì)片段在150-300bp之間，建庫加入約140bp的接頭后，片段應該分布在300-450bp之間為最好。

2.2. 下機數據結果

2.3. 測序數據質(zhì)量控制

對原始測序數據及去除接頭后的可用數據進(jìn)行質(zhì)量評估。RIP數據一般為雙端測序，因此，每個(gè)測序樣本會(huì )有兩個(gè)測序結果。

評估的具體內容見(jiàn)：

RawData-fastqc 文件鏈接： /result/01.qc/qc_rawdata/*.html
CleanData-fastqc 文件鏈接： /result/01.qc/qc_cleandata/*.html
Fastqc 格式補充說(shuō)明： /result/01.qc/qc_Supplement.html

2.4. Peak calling數據統計結果

質(zhì)檢后的reads，采用trim-galory對reads進(jìn)行去接頭，去接頭后，再次對reads進(jìn)行質(zhì)檢，主要檢測接頭是否去除干凈。去除接頭的reads，用hisat2軟件將reads mapping到基因組上，得到reads在基因組上的信息，即.bam文件，將input的.bam文件與IP的.bam文件，通過(guò)MASC2進(jìn)行 peak calling，得到peak文件，即為.bed文件，對得到的peak進(jìn)行注釋?zhuān)⑦M(jìn)行功能分析。

采用常用 reads 富集峰鑒定軟件 MACS2 在全基因范圍進(jìn)行 peak 掃描，得到 Peak 在基因組上的位置信息、peak 富集信息等。

圖 2.4.1 全基因組 Reads 富集峰

使用Chipseeker對Reads富集峰進(jìn)行注釋?zhuān)玫絫ss上下游3k的基因注釋信息。使用bedtools對富集峰與protein coding取交集得到所在基因，對其進(jìn)行后續富集分析。

圖 2.4.2 Peak信息anno流程圖

結果文件見(jiàn)：

reads在基因組上的分布信息： /result/02.callPeak/WGY-target.bw

callPeak peak信息：/result/02.callPeak/WGY-target_peaks.bed

callPeak tss上下游3k注釋信息： /result/02.callPeak/WGY-target.peakanno.csv

callPeak 與 protein coding 交集基因信息： /result/02.callPeak/WGY-target_peaks.tsv

callPeak 與 protein coding 交集基因注釋信息： /result/02.callPeak/gene.list.annoinfo.xls

2.5. Peak 基因注釋與 GO 功能分析

Peak 所在基因進(jìn)行GO 功能分析，并按照基因功能進(jìn)行聚類(lèi)分析。y軸為基因的功能聚類(lèi)，x軸為基因count數，顏色為校正p值。GO功能富集以padj小于0.05作為為顯著(zhù)性富集的閾值，GO分析有3種類(lèi)型，分別為CC(細胞組分），MF(分子功能），BP(生物過(guò)程）。富集結果見(jiàn)：

條形圖縱坐標為GO Term，縱坐標為count數，顏色從紅到紫代表富集的顯著(zhù)性大小。

圖 2.5.1 Peak 相關(guān)基因的GO 功能富集分析（條形圖）

氣泡圖縱坐標為GO Term，點(diǎn)的大小代表注釋到GO Term上的基因數，顏色從紅到紫代表富集的顯著(zhù)性大小

圖 2.5.2 Peak 相關(guān)基因的 GO 功能富集分析（氣泡圖）

結果文件見(jiàn)：

/result/03.Enrichment/go/*

2.6. Peak 基因注釋與 KEGG通路分析

KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)是整合了基因組、化學(xué)和系統功能信息的綜合性數據庫。KEGG通路富集以padj小于0.05作為顯著(zhù)性富集的閾值，富集結果如下表所示，見(jiàn)結果文件：Enrichment/KEGG。 ?從KEGG富集結果中，選取最顯著(zhù)的20個(gè)KEGG通路繪制柱狀圖進(jìn)行展示，若不足20個(gè)，則繪制所有通路，如下圖所示。圖中橫坐標為KEGG通路，縱坐標為通路富集的顯著(zhù)性水平，數值越高越顯著(zhù)。

圖 2.6.1 Peak 相關(guān)基因的KEGG通路富集分析(條形圖）

氣泡圖縱坐標為GO Term，點(diǎn)的大小代表注釋到GO Term上的基因數，顏色從紅到紫代表富集的顯著(zhù)性大小

圖 2.6.2 Peak 相關(guān)基因的KEGG通路富集分析（氣泡圖）

結果文件：

/result/03.Enrichment/kegg/*

附 錄

關(guān)于賽誠生物

廣州賽誠生物科技有限公司是一家專(zhuān)注于科研基礎實(shí)驗服務(wù)及基因測序相關(guān)服務(wù)的生物技術(shù)公司。公司已有成熟的ChIP-seq，RNA-seq，甲基化及各種文庫構建服務(wù)流程，具有豐富的文庫構建和測序分析經(jīng)驗。同時(shí)，公司也開(kāi)發(fā)多項前沿的實(shí)驗技術(shù)，現已形成完善的ATAC-seq，CUT&TAG-seq體系。

除此之外，在基礎科研服務(wù)方面，我們也有巨大優(yōu)勢。傳統優(yōu)勢服務(wù)包括RNA pull down，DNA pull down，RIP，co-IP，細胞功能，流式檢測，FISH等。最近剛剛興起的ChIRP實(shí)驗已成為我們的主流產(chǎn)品，他可以同時(shí)檢測DNA、RNA、蛋白三者互作。

因此，我么擁有一支專(zhuān)注以“表觀(guān)組學(xué)”為核心的醫學(xué)轉化技術(shù)服務(wù)團隊，團隊豐富的的科研經(jīng)驗涵蓋了表觀(guān)基因組學(xué)和基因組學(xué)中的各個(gè)方面，對多個(gè)組學(xué)的數據分析和挖掘有著(zhù)豐富的 經(jīng)驗和全面的理解，比如：基因組修飾、染色質(zhì)調控、基因表達調控、基因組變異等，我們 致力于提供領(lǐng)先的個(gè)性化的表觀(guān)組學(xué)為核心的多組學(xué)整體解決方案。

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