LncRNA Directs Cooperative Epigenetic Regulation Downstream of Chemokine Signals

日期：2017-07-14 標簽：Lnc,RNA,BCAR4,GLI2,Phosphorylation,H3K18,acetylation,Locked,Nucleic,Acid

組蛋白乙?；芯堪咐ǘ?/span>

（一）調控通路：

胞外因子CCL21通過(guò)激活RhoC/CIT通路促進(jìn)GLI2的磷酸化進(jìn)入細胞核，磷酸化的GLI2進(jìn)入細胞核后與LncBCAR4結合一起將SNIP1/P300、PNUTS-Pp1結合到靶標基因的啟動(dòng)子上,誘導啟動(dòng)子組蛋白乙?；?，促進(jìn)靶標基因表達。

（二）實(shí)驗流程：

（三）核心FIGURE：

Figure1說(shuō)明的是CCL21誘導GLI2的磷酸化使其與LncBCAR4結合，促進(jìn)LncBCAR4與SNIP1、PNUTS結合從而促進(jìn)靶標基因的表達。

A、 RNA pull-down，用LncBCAR4探針從MDA-MB-231中釣取與之結合的蛋白，進(jìn)行WB檢測，結果表明LncBCAR4結合蛋白GLI2、SNIP1和PNUTS。

B、 使用CCL21等處理細胞后用WB檢測GLI2的磷酸化情況，表明CCL21能促進(jìn)GLI2的磷酸化。

C、 通過(guò)分別敲低CTL和CIT之后檢測經(jīng)CCL21處理的GLI2，結果表明CCL21不影響GLI2的表達而是影響其磷酸化水平。

D、  用CCL21處理不同時(shí)間后檢測細胞質(zhì)和細胞核的GLI2磷酸化情況。

Figure2說(shuō)明的是LncBCAR4將SNIP1和PNUTS結合到靶標基因啟動(dòng)子上促進(jìn)組蛋白的乙?；?。

A、 CHIP，分別用GLI1和p-GLI2抗體釣取DNA片段，表明CCL21處理后靶標基因啟動(dòng)子上結合的GLI2和p-GLI2上升。

B、 CHIRP，用LncBCAR4探針釣取與之結合的DNA片段進(jìn)行qPCR檢測，結果表明經(jīng)CCL21處理后靶標基因啟動(dòng)子上結合的LncBCAR4增加。

C、 RNA pull-down，用LncBCAR4探針釣取與RNA結合的蛋白，檢測SNIP1、PNUTS與LncBCAR4結合的區域，

D、  EMSA檢測LncRNA與SNIP1、PNUTS的結合。

E、 RIP，反向驗證SNIP1、PNUTS與LncBCAR4結合的區域。

F、 CHIP，靶基因啟動(dòng)子乙?；慕M蛋白，表明CCL21處理后組蛋白乙?；黾?。

G、  用qRT-PCR檢測LncBCAR4敲低后的靶標基因的表達情況,結果表明BCAR4敲低后靶標基因的表達量下降。

本公司可提供的技術(shù)服務(wù)項目

本公司可進(jìn)行類(lèi)似實(shí)驗的實(shí)驗設計及整體實(shí)驗外包項目，包括RNA pull-down、WB、慢病毒穩轉株的建立（過(guò)表達/敲低）、CHIP、RIP、q-pcr，其中RNA pull-down、CHIP、RIP為本公司主營(yíng)項目。

一、RNA pull-down：是檢測RNA結合蛋白與其靶RNA之間的相互作用，主要研究lncRNA與蛋白的相互作用。

用LncBCAR4探針釣取與RNA結合的蛋白，然后用目的蛋白抗體對產(chǎn)物進(jìn)行WB檢測，表明LncRNA BCAR4與CIT、GL12、SNIP1以及PNUTS都能特異性的結合。我公司在實(shí)驗體系中同時(shí)提供lncRNA正義鏈與反義鏈的pull down。

二、CHIP技術(shù)：主要研究蛋白與基因啟動(dòng)子之間的關(guān)系

    例一：

本實(shí)驗GLI2和磷酸化的GLI2抗體進(jìn)行CHIP從不同細胞中獲取與蛋白結合的DNA片段，然后進(jìn)行Q-PCR驗證，實(shí)驗結果表明經(jīng)CCL21處理后的細胞靶標基因啟動(dòng)子上結合的GLI2和p-GLI2上升。

       例二：

本實(shí)驗用乙?；慕M蛋白抗體釣取與之結合的DNA片段，然后進(jìn)行Q-PCR檢測目的基因啟動(dòng)子，結果表明，經(jīng)CCL21處理后啟動(dòng)子上的組蛋白乙?；黠@增加。

三、RIP技術(shù)：主要研究蛋白與RNA的相互作用

本實(shí)驗為了驗證LncRNA與SNIP1結合位點(diǎn)，對LncRNA進(jìn)行相應位點(diǎn)的突變后，用Myc標簽抗體釣取與帶標簽的SNIP1蛋白結合的RNA，然后進(jìn)行QRT-PCR檢測CHIP產(chǎn)物中的RNA，實(shí)驗結果表明與SNIP1蛋白結合的LncRNA結合位點(diǎn)在97-274區間。

 參考文獻：Zhen Xing , Aifu Lin , Chunlai Li，et al. LncRNA Directs Cooperative Epigenetic Regulation Downstream of Chemokine Signals［J］. Cell. 2014, 159(5): 1110–1125.