Cas9敲除基因(knock out)

【概要】

1.設計sgRNA

2.構建sgRNA-Cas9載體

3.構建sgRNA-Cas9穩轉株

4 .篩細胞克隆并進(jìn)行qPCR驗證

5 .陽(yáng)性克隆測序，選擇敲除純合細胞株

6 .篩選細胞單克隆測序

【實(shí)驗技術(shù)】

?1.設計sgRNA

針對小鼠LIF基因座（Mus musculus，NM_008501）設計了三種sgRNA。 進(jìn)行軟件分析以確保sgRNA沒(méi)有預測的脫靶結合位點(diǎn)。

?2.構建sgRNA-Cas9載體

 然后將選擇的sgRNA設計克隆到pLenti-U6-sgRNA-SFFV-Cas9-2A-Puro All-in-One lentivector中（圖1）。

圖1 sgRNA-Cas9載體圖譜

?3.構建sgRNA-Cas9穩轉株

   利用慢病毒包裝體系構建sgRNA-Cas9穩轉株，進(jìn)行嘌呤篩選

?4. 篩細胞克隆并進(jìn)行qPCR驗證

    嘌呤霉素篩選后分離細胞克隆。 提取基因組DNA并進(jìn)行驗證測定目的基因座是否進(jìn)行編輯

圖2 qPCR檢測基因組編輯情況

    在野生型（WT）測定中的單個(gè)條帶表示沒(méi)有發(fā)生編輯; 兩個(gè)較小的條帶（總和WT的長(cháng)度）表示編輯已經(jīng)發(fā)生。圖2表明，克隆 3和6編輯; 克隆2沒(méi)有編輯; 克隆1是不確定的。

?5 .陽(yáng)性克隆測序，選擇突變細胞株

   通過(guò)Sanger測序進(jìn)一步分析細胞集落3和6的PCR產(chǎn)物以確定敲除的性質(zhì)（圖3）。

 圖3 細胞基因組測序結果

    對于細胞集落3，只檢測到一個(gè)突變序列，表明這些細胞可能只是雜合敲除。 在菌落6中檢測到兩種不同的突變序列。

?6. 篩選細胞選擇單克隆純合突變細胞株

    將菌落6連續稀釋到96孔板中進(jìn)行單克隆選擇。 從這些克?。?/span>6a，6b ..）中提取基因組DNA，進(jìn)行PCR擴增，克隆和測序。

圖4 細胞基因測序結果

    測序顯示，在兩個(gè)等位基因中只有克隆6a具有移碼突變（圖4）。 移碼突變破壞了開(kāi)放閱讀框架，導致無(wú)意義介導的mRNA。

?7、進(jìn)一步測序，確定純合突變

    圖5 細胞基因組測序結果

• 1 . CRISPR-Cas9基因沉默
• 2 . CRISPR-Cas9基因敲入
• 3 . dCas9定點(diǎn)調控表達
• 4 . dCas9定點(diǎn)調控表觀(guān)遺傳
• 5 . dCas9介導轉錄調控