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Cas9基因敲入(knock in)
圖1基因敲入原理圖
-、概要
1. 設計sgRNA-Cas9及修復DNA模版
2 .構建sgRNA-Cas9質(zhì)粒及修復DNA模板質(zhì)粒
3 .將sgRNA-Cas9、修復DNA模版共轉293T細胞
4. 嘌呤篩選，檢測熒光
5 .PCR檢測基因組，RFP蛋白是否敲入
針對人類(lèi)AAVS1 AAVS1 Safe Harbor基因設計了sgRNA進(jìn)行軟件分析以確保sgRNA沒(méi)有預測的脫靶結合位點(diǎn)。設計DNA修復模版，兩側同源臂，其兩側各有600bp的同源臂。
將選定的sgRNA設計與CMV啟動(dòng)子驅動(dòng)的Cas9基因一起克隆到pCas-Guide中以制備pCas-Guide-AAVS1（圖2）
將DNA修復模板插入含有RFP-嘌呤霉素的pAAVS1-RFP-DNR表達載體（圖2）。
圖2 sgRNA-Cas9質(zhì)粒及修復DNA模版質(zhì)粒
用lipofectmine2000轉染試劑將上述兩種質(zhì)粒轉染至293T細胞。
4. 嘌呤篩選，檢測熒光
嘌呤篩選3-4周
3-4周后，> 95％的HEK293細胞表達RFP（圖3）。
圖3 熒光檢測圖片 A轉染篩選后明場(chǎng)圖片 B轉染篩選后熒光圖片 C未轉染加嘌呤篩選細胞
為了證實(shí)在基因組DNA中敲入RFP，設計引物對，引物1靶向RFP上游的5'同源臂和靶向RFP-嘌呤霉素基因內的引物2。
1.1kb的PCR產(chǎn)物表明在AAVS1位點(diǎn)敲入成功; 沒(méi)有PCR擴增指示敲入不成功（圖4）。
在對照細胞（'WT細胞'）中沒(méi)有看到PCR擴增。
