CCAT2, a novel noncoding RNA mapping to 8q24,underlies metastatic progression and chromosomal instability in colon cancer

日期：2017-08-15 標簽：CCAT2

轉錄因子相關(guān)調控研究案例（一）

一、調控通路

LncRNA CCAT2由rs69x3267snp基因轉錄產(chǎn)生，CCAT2的表達結合轉錄因子TCF7L2并將其結合到靶標基因啟動(dòng)子上促進(jìn)基因轉錄為RNA，這些靶標基因編碼與細胞增殖相關(guān)的蛋白，同時(shí)轉錄的RNA經(jīng)剪切加工后可產(chǎn)生miR-17-5p。

二、實(shí)驗流程

作者首先用Q-PCR檢測結腸癌病人樣本中結腸癌細胞和癌旁組織細胞的LncRNA表達，表明LncRNA CCAT2在結腸癌細胞中高表達，然后用原位雜交驗證LncRNA在結腸癌細胞中的高表達從而確定了本文的主角LncRNA CCAT2。隨后作者對CCAT2分別進(jìn)行功能研究和作用機制研究。（1）功能研究：作者建立CCAT2的過(guò)表達穩定細胞株進(jìn)行小鼠體內成瘤試驗和細胞遷移試驗，建立CCAT2敲低穩定株進(jìn)行細胞侵襲實(shí)驗和基因不穩定性檢測說(shuō)明CCAT2對腫瘤細胞增殖的作用。（2）機制研究：機制研究可分為兩個(gè)方面，一是在較大的方向上說(shuō)明CCAT2促進(jìn)MYC和miR-17-5p的表達，二是說(shuō)明CCAT2通過(guò)招募轉錄因子促進(jìn)MYC和miR-17-5p表達。作者首先用Q-PCR和WB檢測CCAT2過(guò)表達/敲低細胞的MYC的表達說(shuō)明CCAT促進(jìn)MYC基因轉錄為mRNA，用q-pcr檢測CCAT2過(guò)表達后microRNA的表達說(shuō)明CCAT2促進(jìn)miR-17-5p的表達，通過(guò)添加microRNA的反向互補序列檢測細胞的遷移，說(shuō)明miR-17-5a促進(jìn)細胞遷移。作者用Q-PCR檢測細胞核質(zhì)分離后的CCAT2表明CCAT2在細胞核內，隨后通過(guò)CHIP和RIP實(shí)驗驗證CCAT2和轉錄因子TCF7L2與Myc啟動(dòng)子結合，然后用FISH檢測CCAT2過(guò)表達細胞的MYC表達等一系列實(shí)驗說(shuō)明CCAT2通過(guò)招募轉錄因子激活基因轉錄促進(jìn)蛋白表達。最后作者檢測CCAT2過(guò)表達后的CD44和vim mRNA說(shuō)明CCAT2促進(jìn)這兩種基因轉錄。

三、核心FIGURE

FIGURE1說(shuō)明的是LncRNA CCAT2促進(jìn)MYC、miR-17-5p、miR-20a的表達，促進(jìn)細胞增殖轉移。

A、     分別用WB和Q-PCR檢測CCAT2過(guò)表達后的MYC表達，表明CCAT2過(guò)表達促使MYC表達升高。

B、     Q-pcr檢測CCAT2過(guò)表達后的microRNA的表達，結果表明CCAT2過(guò)表達使miR-17-5p和miR-20a表達升高，miR-146a表達下降。

C、     別用WB和Q-PCR檢測CCAT2敲低后的MYC表達，表明CCAT2敲低促使MYC表達下降。

D、     通過(guò)添加microRNA的反向互補序列檢測細胞的遷移，表明miR-17-5a和miR-20a的互補序列使細胞遷移能力下降。說(shuō)明miR-17-5a和miR-20a促進(jìn)細胞遷移。

     Figure2說(shuō)明的是CCAT2結合轉錄因子TCF7L2到MYC等基因啟動(dòng)子上促進(jìn)表達。

A、     核質(zhì)分離后，q-pcr檢測CCAT2，表明CCRT2在細胞核內。

B、     CHIP實(shí)驗，用轉錄因子蛋白TCF7L2抗體釣取與之結合的DNA片段，然后進(jìn)行q-pcr檢測，表明TCF7L2與MYC啟動(dòng)子結合。

C、     RIP實(shí)驗，用轉錄因子蛋白TCF7L2抗體釣取與之結合的RNA片段，然后進(jìn)行q-pcr檢測，表明TCF7L2與lncRNA CCAT2結合。

D、     蛋白FISH，用熒光免疫原位雜交檢測CCAT2過(guò)表達細胞的波形蛋白，表明CCAT2過(guò)表達細胞的波形蛋白信號很強。

E、     Q-PCR檢測CCAT2過(guò)表達后的CD44和波形蛋白mRNA的表達。

本公司可提供的技術(shù)服務(wù)

本公司可進(jìn)行以上類(lèi)似實(shí)驗的實(shí)驗設計及整體實(shí)驗外包項目，包括Q-PCR、Western Blot、CHIP實(shí)驗、慢病毒穩轉株的建立（過(guò)表達/敲低）、RIP實(shí)驗等，其中的CHIP實(shí)驗、RIP、蛋白FISH為本公司主營(yíng)項目。

一、 CHIP實(shí)驗：主要研究蛋白與基因啟動(dòng)子之間的關(guān)系。

本實(shí)驗作者用轉錄因子蛋白TCF7L2抗體釣取與蛋白結合的DNA片段，然后用Q-PCR檢測CHIP產(chǎn)物是否含有MYC啟動(dòng)子序列，說(shuō)明了TCF7L2與MYC啟動(dòng)子結合。我公司在實(shí)驗體系中設置陽(yáng)性及陰性對照，進(jìn)一步排除系統誤差。

二、RIP實(shí)驗，主要研究蛋白與RNA的相互作用。

本實(shí)驗作者用轉錄因子蛋白TCF7L2抗體釣取與蛋白結合的RNA片段，然后用Q-PCR檢測RIP產(chǎn)物,說(shuō)明了TCF7L2與LncRNA CCAT2結合。我公司在實(shí)驗體系中設置陽(yáng)性及陰性對照，進(jìn)一步排除系統誤差。

   三、蛋白FISH，即蛋白免疫熒光原位雜交：細胞內蛋白的定性、定位和定量。

本實(shí)驗作者用熒光免疫原位雜交檢測CCAT2過(guò)表達細胞的波形蛋白，表明CCAT2過(guò)表達細胞的波形蛋白信號很強，說(shuō)明CCAT2過(guò)表達促進(jìn)波形蛋白表達。我公司在實(shí)驗體系中設置陰性和陽(yáng)性對照。

參考文獻：Hui Ling,Riccardo Spizzo,Yaser Atlasi,et al. CCAT2, a novel noncoding RNA mapping to 8q24,underlies metastatic progression and chromosomal instability in colon cancer［J］. Genome Research, 2013,23:1446–1461