lncRNA-dependent mechanisms of androgenreceptor-regulated gene activation programs

日期：2017-08-18 標簽：lncRNA-dependent,mechanisms,of,androgenreceptor-regulated,gene,activation,programs

轉錄因子相關(guān)調控研究案例（三）

一、    調控通路

DHT刺激細胞后，雄激素受體（AR）C-端與LncRNA PRNCR1結合，聯(lián)合另一個(gè)LncRNA PCGEM1招募DOT1L將AR的A-端甲基化；LncRNA PCGEM1同時(shí)與PYGO2結合，然后LncRNA將AR和PYGO2結合到靶標基因的增強子區促進(jìn)基因的表達。

二、    實(shí)驗流程

作者首先用AR抗體進(jìn)行RIP實(shí)驗獲得了與AR結合的LncRNA PRNCR1和PCGEM1，又通過(guò)CHIRP實(shí)驗驗證了AR與LncRNA PCGEM1以及基因組蛋白的關(guān)系，RNA pull-down驗證LncRNA PRNCR1和PCGEM1結合AR；隨后作者通過(guò)一系列的RNA pull-down實(shí)驗驗證LncRNA PCGEM1與AR、PYGO2、DOT1L的互作關(guān)系；為了說(shuō)明LncRNA PRNCR1和PCGEM1參與基因的轉錄過(guò)程，作者對LncRNA進(jìn)行敲低后檢測靶標基因Mrna的表達；為了檢測AR與LncRNA的結合位點(diǎn)，作者使用RIP實(shí)驗進(jìn)行驗證；最后作者通過(guò)一系列的CHIP實(shí)驗驗證LncRNA、AR、PYGO2與靶基因啟動(dòng)子、增強子的互作，作者對LncRNA敲低后細胞進(jìn)行CHIP實(shí)驗說(shuō)明PYGO2的靶基因的作用是由LncRNA介導的。

三、核心FIGURE

Figure1說(shuō)明的是前列腺癌細胞特異LncRNA與雄激素受體（AR）的相互作用。

a-b、RIP實(shí)驗，用AR抗體釣取前列腺癌細胞和普通畸形前列腺增生細胞中AR結合的RNA，然后進(jìn)行Q-PCR檢測，表明前列腺癌細胞的lncRNA PCNCR1和PCGEM1高度結合。

c、RIP實(shí)驗，用AR抗體釣取經(jīng)二氫睪酮處理后細胞中與AR結合的RNA，結果表明二氫睪酮誘導AR結合lncRNA PCNCR1和PCGEM1。

d、RIP實(shí)驗，用AR分別釣取PCNCR1敲低，PCGEM1敲低細胞中結合的RNA，結果表明PCNCR1敲低后兩種LncRNA與AR結合均下降，而PCGEM1敲低后，PCNCR1與AR的結合不受影響。

E、CHIRP實(shí)驗，細胞經(jīng)DHT處理后，用PCGEM1探針釣取與之結合的核酸和蛋白。

Figure2說(shuō)明的是LncRNA與轉錄因子/共激活物的互作。

a-b、RIP，對AR進(jìn)行突變，然后用Flag標簽抗體釣取經(jīng)二氫睪酮處理后與AR結合的RNA，結果表明AR的K631/634Q突變后，LncRNA結合明顯增強，說(shuō)明AR K631/634的乙?；?/span>LncRNA與AR相互作用增強。K349R突變后，PCGEM1結合降低表明AR結合PCGEM1需要K349的甲基化。

c、AR的體外甲基化實(shí)驗，DOT1L使AR甲基化。

d、RNA pull-down，將AR分為不同片段連接到表達載體上轉染細胞，然后用PRNCR1探針做Pull down，結果表明PRNCR1結合AR的區段為549-623位氨基酸之間。

e、RNA pull-down，將AR分為不同片段連接到表達載體上，與DOT1L表達載體共同轉染細胞，然后用PCGEM1探針做Pull down，結果表明在AR的K349甲基化后PCGEM1與AR的N-段結合。

f、RNA pull-down，用PCGEM1全長(cháng)和截短探針釣取與之結合的蛋白，然后用WB檢測AR和PYGO2，表明PCGEM1結合AR的區段為411-490，結合PYGO2區段在1191-1270。

Figure3說(shuō)明的是Lnc促使PRGO2和AR結合到靶標基因的增強子區促進(jìn)基因表達。

A、q-pcr檢測AR表達，LncRNA敲低細胞的PSA等基因的表達，表明AR的表達促進(jìn)靶標基因的表達，而LncRNA敲低后靶標基因的表達下降。

B、CHIP-3C，表明PSA基因結合AR的區域。

C-D、CHIP，用PYGO2抗體釣取經(jīng)HDT處理的細胞與PYGO2結合的DNA片段，然后進(jìn)行Q-PCR驗證，表明HDT處理后PYGO2結合到PSA基因的增強子區和啟動(dòng)子區。

E、CHIP-3C，表明PYGO2敲低后，結合的PSA增強子減少。

F、CHIP，LncRNA敲低后，用AR抗體釣取與蛋白結合的DNA片段然后繼續Q-PCR檢測，表明LncRNA敲低后AR結合靶標基因減少。

本公司可提供的技術(shù)服務(wù)項目

本公司可進(jìn)行類(lèi)似實(shí)驗的實(shí)驗設計及整體實(shí)驗外包項目，包括RNA pull-down、RIP、CHIRP、WB、慢病毒穩轉株的建立（過(guò)表達/敲低）、Q-PCR、CHIP，其中RIP、CHIRP、RNA pull-down、CHIP為本公司主營(yíng)項目。

一、RIP：主要--研究蛋白與RNA的相互作用

作者分別用AR抗體釣取細胞中與AR蛋白結合的RNA，然后進(jìn)行q-pcr驗證，結果表明LncRNA PRNCR1和PCGEM1與AR結合。我公司在實(shí)驗體系中設置陽(yáng)性及陰性對照，進(jìn)一步排除系統誤差。

二、CHIRP：檢測與RNA綁定的DNA和蛋白相互作用的方法。

在本實(shí)驗中，作者用PCGEM1探針釣取經(jīng)DHT處理后的細胞中與PCGEM1結合的蛋白和DNA片段，然后進(jìn)行Q-PCR和WB檢測。

三、RNA pull-down：檢測RNA結合蛋白與其靶RNA之間相互作用的主要實(shí)驗手段之一。

 用PRNCR1探針釣取純化的MYC-標簽的AR融合蛋白，然后進(jìn)行WB驗證，結果表明了LncRNA PRNCR與AR直接結合，結合的AR區域為549-623位氨基酸區域。我公司在實(shí)驗體系中同時(shí)提供lncRNA正義鏈與反義鏈的pull down。

四、CHIP：主要研究蛋白與基因啟動(dòng)子之間的關(guān)系

 用PYGO2抗體釣取細胞內與PYGO2蛋白結合的DNA片段，然后進(jìn)行Q-PCR檢測，結果表明DHT刺激后PYGO2結合PSA基因的增強子區和啟動(dòng)子區，LncRNA干擾表達后結合降低。

參考文獻：Liuqing Yang, Chunru Lin, Chunyu Jin,et al. lncRNA-dependent mechanisms of androgenreceptor-regulated gene activation programs［J］.Nature,2013,500(7464): 598–602