轉錄因子相關(guān)研究案例（四）

日期：2017-09-21 標簽：Noncoding,RNA

Noncoding RNA Gas5 Is a Growth Arrest and StarvationAssociated Repressor of the Glucocorticoid Receptor

一、調控通路

Gas5是一種在細胞缺乏營(yíng)養物質(zhì)或生長(cháng)因子導致生長(cháng)停滯時(shí)高表達的非編碼RNA，通過(guò)抑制糖皮質(zhì)激素介導的幾個(gè)應答基因的表達促進(jìn)細胞凋亡。Gas5作為糖皮質(zhì)激素響應原件誘餌與響應原件（GRE）競爭結合到糖皮質(zhì)激素受體（GR）的DNA結合位點(diǎn)，調控基因的表達。

二、實(shí)驗流程

作者首先通過(guò)RIP實(shí)驗驗證了在Dex處理后非編碼RNA Gas5與GR結合增加，然后又通過(guò)熒光素酶實(shí)驗驗證了Gas5通過(guò)與GR互作抑制下游靶標基因的表達。作者另外通過(guò)RNA免疫熒光原位雜交的核質(zhì)分離來(lái)說(shuō)明細胞受Dex刺激后Gas5和GR從細胞質(zhì)中轉移進(jìn)入細胞核起作用，然后通過(guò)chip實(shí)驗表明dex刺激使細胞GR結合到靶標基因啟動(dòng)子降低抑制基因的表達。隨后作者分別對Gas5進(jìn)行過(guò)表達和敲低后用dex處理細胞，檢測與GR應答相關(guān)基因的表達，表明dex刺激Gas與GR互作抑制靶標基因表達。作者最后通過(guò)Gas5不同片段以及預測的與GR結合位點(diǎn)突變的熒光素酶實(shí)驗驗證Gas5與GR的結合位點(diǎn)。

三、核心FIGURE

Figure1說(shuō)明的是Gas5與GR結合互作抑制其對響應原件基因的轉錄激活活性。

A-B、RIP實(shí)驗，用GR抗體釣取Dex處理和未處理細胞中與GR結合的RNA，然后進(jìn)行q-pcr檢測，表明在Dex處理后，細胞的Gas5與GR結合增加。

C、熒光素酶實(shí)驗，將Gas5表達質(zhì)粒、GR表達質(zhì)粒和連接GRE的熒光素酶報告質(zhì)粒共轉染細胞，然后檢測熒光素酶活性，表明Gas5抑制GR的轉錄活性但不抑制包含GAL4的嵌合體的轉錄活性。

Figure2說(shuō)明的是Gas5在細胞質(zhì)和細胞核中都存在，在Dex處理后Gas5轉移進(jìn)入細胞核參與GR應答。

A、 RNA FISH，用Gas5探針檢測細胞中的Gas5的定位，表明細胞核和細胞質(zhì)中均含有Gas5，下圖使用RNase處理作為陰性對照。

B、 核質(zhì)分離，用Dex處理細胞后進(jìn)行核質(zhì)分離，然后分別檢測細胞質(zhì)和細胞核的GR和Gas5，表明Dex處理使細胞質(zhì)中的Gas5和GR轉移進(jìn)入細胞核。

Figure3說(shuō)明的是Gas5的過(guò)表達抑制GR與響應原件基因互作抑制基因mRNA的表達。

A、 Gas5過(guò)量表達檢測。

B、 Gas5過(guò)量表達后檢測clAP2 Mrna的表達，表明Gas5過(guò)量表達后Dex的處理使clAP2 mRNA的表達降低。

C、 ChIP實(shí)驗，用GR抗體釣取Dex處理和未處理的Gas5過(guò)量表達細胞中與GR結合的DNA片段，然后進(jìn)行q-pcr檢測跑膠，表明Dex處理使GR結合到clAP2啟動(dòng)子上減少。

Figure4說(shuō)明的是Gas5抑制GR誘導的糖皮質(zhì)激素應答基因mRNA的表達。

A、 Gas5表達質(zhì)粒轉染細胞后，用Dex處理，然后檢測細胞GR誘導的基因mRNA的表達，表明Gas5表達使mRNA表達降低。

B、 ChIP實(shí)驗，Gas5表達質(zhì)粒轉染細胞后，用Dex處理，然后用GR抗體釣取細胞中與GR/GRE結合的DNA片段，進(jìn)行q-pcr檢測，表明Gas5表達使GR/GRE與基因啟動(dòng)子結合降低。

                                  本公司可提供的技術(shù)服務(wù)

本公司可進(jìn)行以上類(lèi)似實(shí)驗的實(shí)驗設計及整體實(shí)驗外包項目，包括q-pcr、核質(zhì)分離、Luciferase assay、FISH、RIP、ChIP、WB、慢病毒穩轉株的建立（過(guò)表達/敲低），其中核質(zhì)分離、Luciferase assay 、FISH、RIP、ChIP為本公司主營(yíng)項目。

一、Luciferase assay：熒光素酶實(shí)驗檢測轉錄因子與基因啟動(dòng)子之間的關(guān)系

將Gas5表達質(zhì)粒、GR表達質(zhì)粒和連接GRE基因的熒光素酶報告質(zhì)粒共轉染細胞，并用Dex處理細胞，然后檢測細胞的熒光素酶活性，表明Gas5抑制GR促進(jìn)基因轉錄的活性但不抑制包含GAL4的GR嵌合體的活性。

二、RNA-FISH：RNA的免疫熒光原位雜交技術(shù)，對細胞中RNA進(jìn)行定位的重要方法。

用Gas5的RNA探針檢測細胞內的Gas5，綠色熒光為Gas5的位置，藍色為細胞核位置，作者用Rnase處理細胞作為陰性對照，表明Gas5存在于細胞質(zhì)和細胞核中。我公司在實(shí)驗體系中設置陰陽(yáng)性?xún)葏ⅰ?/span>

三、核質(zhì)分離：對細胞質(zhì)和細胞核進(jìn)行分類(lèi)后，檢測其中目的RNA或蛋白含量，是RNA和蛋白定位的重要手段之一。

用Dex處理細胞后進(jìn)行核質(zhì)分離，然后分別檢測其中的Gas5和GR，表明Dex處理使細胞質(zhì)中的Gas5和GR轉移進(jìn)入細胞核。Α-tubulin是細胞質(zhì)的標志物，Oct1是細胞核的標志物。

四、RIP：RNA免疫共沉淀技術(shù)，是研究RNA與蛋白互作的重要手段。

用GR抗體釣取Dex處理和未處理細胞中與GR結合的RNA，然后進(jìn)行q-pcr檢測，表明在Dex處理后，細胞的Gas5與GR結合增加。我公司在實(shí)驗體系中設置陽(yáng)性及陰性對照，進(jìn)一步排除系統誤差。

五、ChIP：染色質(zhì)免疫共沉淀技術(shù)，主要研究轉錄因子與靶標基因啟動(dòng)子之間的關(guān)系

用GR抗體釣取Dex處理和未處理的Gas5過(guò)量表達細胞中與GR結合的DNA片段，然后進(jìn)行q-pcr檢測跑膠，表明Dex處理使GR結合到clAP2啟動(dòng)子上減少。我公司在實(shí)驗體系中設置陽(yáng)性及陰性對照，進(jìn)一步排除系統誤差。

參考文獻：Tomoshige Kino,Darrell E. Hurt,Takamasa Ichijo,et al. Noncoding RNA Gas5 Is a Growth Arrest and StarvationAssociated Repressor of the Glucocorticoid Receptor[J]. Sci Signal,2010, 3(107): ra8