Transcriptional and Epigenetic Regulation of KIF14 Overexpression in Ovarian Cancer

日期：2017-08-23 標簽：Transcriptional,and,Epigenetic,Regulation,of,KIF14,Overexpression,in,Ovarian,Cancer

DNA甲基化研究案例（一）

一、調控通路

在正常細胞中，為了維持平衡，KIF14基因啟動(dòng)子的DNA是以甲基化狀態(tài)存在；當細胞發(fā)生癌變時(shí)，轉錄因子SP1和YY1結合到KIF14基因啟動(dòng)子上促使DNA去甲基化從而促進(jìn)KIF14的表達。另外，本文還簡(jiǎn)單的表明了miR-382抑制KIF14的表達。

二、實(shí)驗流程

作者首先通過(guò)熒光素酶活性實(shí)驗說(shuō)明了轉錄因子SP1、YY1的KIF14啟動(dòng)子活性的影響，然后建立SP1和YY1敲低細胞株檢測KIF14的表達；為了進(jìn)一步驗證SP1、YY1與KIF14啟動(dòng)子的關(guān)系，作者先用CHIP實(shí)驗驗證了SP1、YY1與啟動(dòng)子的結合，然后通過(guò)甲基化PCR實(shí)驗說(shuō)明SP1和YY1促使KIF14啟動(dòng)子的DNA去甲基化；最后作者通過(guò)檢測KIF14高表達/低表達細胞中microRNA的表達和microRNA敲低后的KIF14 Mrna的表達簡(jiǎn)單的說(shuō)明miR-382抑制KIF14 mRNA的表達。

三、核心FIGURE

Figure1說(shuō)明的是轉錄因子SP1和YY1與KIF14啟動(dòng)子互作影響該基因的表達。

A、 啟動(dòng)子熒光素酶活性實(shí)驗，表明轉錄因子SP1和YY1影響KIF14啟動(dòng)子活性。

B、 Qpcr檢測轉錄因子SP1和YY1敲低后KIF14 mRNA的表達，表明SP1和YY1敲低后KIF14 mRNA水平下降。

C、 WB檢測轉錄因子SP1和YY1敲低后KIF14蛋白的表達，明SP1和YY1敲低后KIF14蛋白水平下降。

Figure2說(shuō)明的是轉錄因子SP1和YY1結合到KIF14啟動(dòng)子上促進(jìn)DNA去甲基化。

A、 CHIP實(shí)驗，分別用轉錄因子蛋白SP1和YY1抗體釣取結合的DNA片段，然后進(jìn)行Q-PCR檢測，結果表明腫瘤細胞的SP1和YY1與KIF14啟動(dòng)子高度結合。

B、 甲基化分析，用甲基化特異引物進(jìn)行q-PCR檢測正常細胞和腫瘤細胞的KIF14啟動(dòng)子DNA甲基化情況，結果表明腫瘤細胞去甲基化程度上升。

Figure3說(shuō)明的是miR-382抑制KIF14的表達。

A、Q-PCR檢測KIF14高表達和低表達細胞的microRNA，篩選出幾個(gè)差異表達的microRNA。

B、通過(guò)對micro的抑制檢測KIF14 mRNA的表達情況，結果表明miR-382受抑制后KIF14 mRNA表達上升，說(shuō)明miR-382可抑制KIF14的表達。

本公司可提供的技術(shù)服務(wù)

本公司可進(jìn)行以上類(lèi)似實(shí)驗的實(shí)驗設計及整體實(shí)驗外包項目，包括Q-PCR、Western Blot、Luciferase檢測、CHIP、慢病毒穩轉株的建立（過(guò)表達/敲低），其中的Luciferase檢測、CHIP為本公司主營(yíng)項目。

一、 Luciferase檢測：

作者分別將YY1、HSF1、SP1表達載體與KIF14啟動(dòng)子熒光素酶載體轉染細胞，然后檢測熒光素酶活性。

二、 CHIP技術(shù)：主要研究蛋白與基因啟動(dòng)子之間的關(guān)系。

作者分別用SP1和YY1抗體釣取細胞中與蛋白結合的DNA片段，然后進(jìn)行Q-PCR驗證，表明腫瘤細胞的SP1和YY1與KIF14啟動(dòng)子高度結合。

參考文獻：Brigitte L.The ′riault,Halesha D.Basavarajappa, Harvey Lim,et al.Transcriptional and Epigenetic Regulation of KIF14 Overexpression in Ovarian Cancer［J］.PLoS ONE,2014,9(3):e91540.