DNA甲基化文獻賞析之一： TET1介導FOXA1依賴(lài)性增強子的活躍表觀(guān)遺傳修飾

圖1 FOXA1誘導TET1表達并與之互作調控增強子的表觀(guān)修飾

    為了確定FOXA1和活性增強子標記之間的相關(guān)性，作者重新分析了先前發(fā)表的對照組和FOXA1敲低組的FOXA1，H3K4me2和H3K27ac ChIP-seq數據，以及進(jìn)行了MeDIP和hMe-Seal的高通量測序分析確認FOXA1結合位點(diǎn)（FXBS）確實(shí)富含 H3K4me2和H3K27ac（圖2A）, 并且雖然所有FOXA1占據位點(diǎn)周?chē)?mC的平均強度在FOXA1敲低時(shí)沒(méi)有受到很大影響（圖2B），但5hmC顯著(zhù)下降（圖2C），

而以FOXA1峰下游20kb的基因組區域（在本文中稱(chēng)為非峰位點(diǎn)）作為陰性對照的量度，沒(méi)有表現出任何明顯的模式（圖2A：底部，圖2D和E）?？紤]到5hmC豐度僅占胚胎干細胞中5mC的大約10％，在5hmC比5mC中觀(guān)察到更顯著(zhù)的變化是合理的。隨后的MeDIP和hMe-Seal對各個(gè)FXBS基因進(jìn)行qPCR，在許多FXBS中，FOXA1敲低后5hmC大大降低（圖2F）。從這些結果可以推斷，FOXA1可以在其占據的區域特異性地改變DNA甲基化以實(shí)現去甲基化狀態(tài)，同時(shí)積累5hmC標記，從而增加增強子活化。

圖2 FOXA1通過(guò)表觀(guān)遺傳修飾促進(jìn)增強子活化。

A ChIP-seq、MeDIP和hMe-Seal高通量測序分析的熱圖呈現FXBS位點(diǎn)H3K4me2、H3K27ac、5hmC和5mC的富集；

B和C 顯示的所有FXBS周?chē)ˋ上）5mC（B）和5hmC（C）富集的平均強度圖；

D和E 顯示的所有非峰位點(diǎn)周?chē)ˋ下）5mC（D）和5hmC（E）富集的平均強度圖；

F 在對照和shFOXA1 LNCaP細胞對hMe-Seal進(jìn)行的代表性FXBS基因Qpcr檢測5hmC特異性變化。

（1）FOXA1正調控TET1的表達

   由于TET蛋白催化的DNA去甲基化，作者接下來(lái)檢測TET基因表達是否與FOXA1相關(guān)。首先在一組12個(gè)前列腺細胞系中對FOXA1和TET1轉錄物進(jìn)行qRT-PCR分析，結果表明TET1與FOXA1的表達趨勢相似（圖3A,B）。那么FOXA1是否調節TET1基因表達？為了測試這一點(diǎn)，首先檢測了對照或FOXA1敲低的LNCaP細胞中的TET1水平，在FOXA1敲低后LNCaP細胞中TET1轉錄物和蛋白質(zhì)水平均顯著(zhù)降低（圖3C，D），同時(shí)，另一種獨立的前列腺癌細胞系C4-2B中FOXA1的消耗也導致TET1表達的降低（圖3E）。另一方面，當FOXA1在22Rv1和DU145細胞中過(guò)表達時(shí)，TET1表達增強（圖3F,G）。為了在細胞水平上可視化FOXA1對TET1的誘導作用，進(jìn)行了免疫熒光染色。在用空載體對照的DU145細胞中幾乎檢測不到TET1，在用腺病毒FOXA1感染（Flag標記，顯示為紅色）時(shí)，TET1染色（以綠色顯示）顯著(zhù)增強（圖3H）。這些數據支持FOXA1正調節TET1基因的表達。

圖3 FOXA1誘導TET1表達

A和B q-pcr檢測12個(gè)前列腺細胞系的FOXA1和TET1基因的表達

C和D 分別q-pcr和WB檢測LNCaP細胞系中FOXA1敲低對TET1表達的影響

E 分別q-pcr和WB檢測C4-2B細胞系中FOXA1敲低對TET1表達的影響

F和G WB檢測22Rv1和DU145細胞系中FOXA1過(guò)表達對TET1表達的影響

H 免疫熒光檢測FOXA1表達對TET1表達的影響

（2）TET1基因是FOXA1的直接靶標

為了確定FOXA1如何轉錄控制TET1表達，作者分析了先前從LNCaP細胞獲得的FOXA1 ChIP-seq數據，并在TET1基因的外顯子區域內，即外顯子3和4之間觀(guān)察到強烈的FOXA1結合（圖4A）。與FOXA1通過(guò)增強子-啟動(dòng)子環(huán)化調節靶基因的增強子一致，作者還在TET1啟動(dòng)子處發(fā)現了弱的FOXA1結合。為了驗證ChIP-seq的結果，進(jìn)行了ChIP-qPCR，發(fā)現FOXA1在TET1增強子中相對于IgG對照富集了近170倍，并且在TET1啟動(dòng)子處約10倍（圖4B），富集水平與前列腺特異性抗原基因增強子（PSA）相當。此外，在敲低后，富集水平大大減少（圖4C）。接下來(lái)，為了檢查T(mén)ET1增強子和啟動(dòng)子處的FOXA1占據是否導致其轉錄活性的調節，作者將這些區域克隆到熒光素酶報道構建體中。熒光素酶測定顯示FOXA1過(guò)表達確實(shí)顯著(zhù)增加而FOXA1敲低減少TET1增強子和啟動(dòng)子活性（圖4D和E）。為了進(jìn)一步證明該調節是由于TET1增強子和啟動(dòng)子的FOXA1占據，對TET1增強子和啟動(dòng)子內FKHD基序的FOXA1結合峰周?chē)腄NA進(jìn)行突變測定，熒光素酶測定顯示FKHD基序的突變消除了TET1增強子的FOXA1調節以及啟動(dòng)子活性（圖4F）。這些數據支持FOXA1直接結合TET1的調控元件以誘導其轉錄。

圖4 FOXA1結合到增強子和啟動(dòng)子誘導TET1表達

A CHIP-seq數據分析表明FOXA1在TET1基因的啟動(dòng)子和增強子區域富集；

B和C CHIP-QPCR驗證FOXA1在TET1啟動(dòng)子和增強子區域的富集；

D和E 熒光素酶實(shí)驗驗證FOXA1對TET1啟動(dòng)子和增強子活性的影響；

F 對TET1啟動(dòng)子和增強子區域FOXA1結合位點(diǎn)突變后的熒光素酶實(shí)驗驗證。

（1）FOXA1的FH結構域與TET1的CXXC結構域互作

由于FOXA1有助于局部DNA去甲基化（圖2），TET1是已知的DNA去甲基化酶，作者假設TET1的作用可能歸因于FXBS周?chē)腄NA去甲基化。為了驗證這一假設，作者研究了FOXA1和TET1蛋白之間的潛在相互作用。首先用Flag標記的TET1和FOXA1或空載體共轉染293T細胞使用抗FOXA1抗體進(jìn)行CO-IP，確認FOXA1能將TET1蛋白拉下（圖5A），然后將TET1克隆到SFB標記的表達載體中，這使得能夠使用S-蛋白瓊脂糖珠下拉TET1蛋白并通過(guò)抗Flag抗體檢測，CO-IP結果表明TET1蛋白能拉下FOXA1（圖5B）。圖5C則是直接的用蛋白本身的抗體相互IP證明兩者具有細胞內源性互作。為了進(jìn)一步確定與FOXA1的互作的TET1蛋白結構域，作者構建了四個(gè)Myc標記的TET1結構域構載體，即N末端，CXXC，中間和CD結構域，與用SFB標記的FOXA1共轉染到293T細胞中。S-pull down下拉的WB顯示僅含有CXXC模塊的TET1片段能夠結合FOXA1（圖5D）。另一方面，為了找出與TET1蛋白互作的FOXA1結構域。類(lèi)似地，構建了三個(gè)Flag標記的FOXA1結構域構建體，即N-末端，Forkhead（FH）和C-末端結構域，其與SFB標記的TET1-CXXC結構域共轉染到293T細胞中然后進(jìn)行S-pull down的WB檢測，結果顯示FOXA1的FH結構域與TET1的CXXC結構域互作（圖5E）。

圖5 FOXA1與TET互作

A-C CO-IP驗證FOXA1與TET1的互作關(guān)系

D CO-IP檢測與FOXA1結合的TET1結構域為CXXC

E CO-IP檢測與TET1結構域CXXC結合的FOXA1結構域為FH

（2）TET1介導FOXA1依賴(lài)性增強子的表觀(guān)遺傳激活

為了確定TET1是否影響FOXA1占據的增強子的表觀(guān)遺傳修飾，首先測試TET1是否能夠共同占據FOXA1結合的基因組區域。通過(guò)ChIP-qPCR表明在表達HA-TET1的細胞中比在用HA-對照載體轉染的細胞中FXBS富集更強的HA（TET1）富集（圖6A）。接下來(lái)，為了檢測TET1如何改變這些FOXA1結合區域周?chē)腄NA甲基化，shRNA進(jìn)行了TET1敲低（圖6B）。然后通過(guò)hMe-Seal-seq檢測5hmCTET1敲低后總5hmC富集區域顯著(zhù)減少（圖6C）和MeDIP-seq檢測5mC顯示增加了近33％（圖6D）。所有峰的平均強度視圖顯示hMe-Seal信號顯著(zhù)降低，而MeDIP信號在TET1敲低后增加（圖6E）。圍繞FXBS的基因增強子表觀(guān)遺傳修飾的分析在TET1耗盡后總體減少5hmC和增加5mC，表明TET1對于維持這些增強子的去甲基化狀態(tài)是關(guān)鍵的（圖6F和G）。由于已顯示DNA甲基化抑制增強子激活，接下來(lái)檢測TET1敲低是否阻止FXBS的增強子激活。ChIP-qPCR顯示在TET1耗盡后H3K4me2和H3K27ac確實(shí)均顯著(zhù)降低（圖6H和1）。進(jìn)一步ChIP-seq證實(shí)了TET1敲低中H3K4me2水平的全局下降（圖6J）。這些數據支持TET1表達通過(guò)介導活性DNA去甲基化促進(jìn)FOXA1-靶標增強子的活化。

圖6 TET1表達通過(guò)介導活性DNA去甲基化促進(jìn)FOXA1-靶標增強子的活化

A HA-TET1 CHIP-QPCR檢測表明TET1在FXBS位點(diǎn)富集

B WB檢測TET1敲低效果

C hMe-Seal和MeDIP-seq數據分析表明TET1敲低后5hmC顯著(zhù)降低5mC增加

E hMe-Seal平均強度視圖

F-G hMe-Seal和MeDIP-seq數據分析聚焦于FXBS位點(diǎn)

H-I CHIP-QPCR檢測FXBS位點(diǎn)的H3K4me2和H3K27ac的富集表明TET1敲低后FXBS位點(diǎn)富集降低

J ChIP-seq證實(shí)TET1敲低中H3K4me2水平的全局下降

報道DNA甲基化和H3K4me2去除可能損害FOXA1結合，在TET1耗盡后觀(guān)察到的DNA甲基化和組蛋白修飾的變化提示FOXA1向這些區域的富集被破壞。為了測試這一點(diǎn)，作者在對照和TET1敲低LNCaP細胞中進(jìn)行FOXA1 ChIP-seq以確定TET1消耗是否能夠調節FOXA1染色質(zhì)靶標。結果顯示在TET1敲低時(shí)，FOXA1結合能力顯著(zhù)降低（圖7A）。此外，即使對于TET1敲低后未完全消除的位點(diǎn)（即共享位點(diǎn)），FOXA1結合的平均強度似乎也弱得多（圖7B）。幾種依賴(lài)于FOXA1的增強子的基因組視圖進(jìn)一步說(shuō)明了TET1耗盡細胞中FOXA1占據的顯著(zhù)喪失（圖7C和D）。同時(shí)，這些增強子的DNA甲基化增加，即5mC增加但5hmC信號減少，而活性增強子標記H3K4me2減少，與全基因組切換到抑制性染色質(zhì)狀態(tài)一致。此外，ChIP-qPCR證實(shí)TET1敲低顯著(zhù)降低多個(gè)靶標增強子的FOXA1占有率（圖7E）。由于TET1通過(guò)其CXXC結構域與FOXA1蛋白相互作用但通過(guò)其CD結構域進(jìn)行酶活性，我們接下來(lái)試圖從機理上理解CD介導的DNA去甲基化是否足夠促進(jìn)FOXA1招募到靶標增強子。為了測試這一點(diǎn)，作者用TET1敲低在LNCaP細胞中過(guò)表達CD結構域。 ChIP-qPCR確認TET1敲低使靶向增強子的FOXA1結合降低，重要的是，可以通過(guò)伴隨的CD結構域過(guò)表達完全挽救（圖7F）。這些數據支持TET1通過(guò)活性去甲基化促進(jìn)FOXA1募集到靶標增強子

圖7 TET1通過(guò)活性去甲基化促進(jìn)FOXA1募集到靶標增強子

A-B CHIP-SEQ統計FOXA1富集量表明TET1敲低后FXBS位點(diǎn)顯著(zhù)降低

C-D SEQ視圖顯示TET1耗盡FOXA1占據靶標降低，活性增強子標記H3K4me2減少，5mC增加但5hmC信號減少

E ChIP-qPCR證實(shí)TET1敲低顯著(zhù)降低多個(gè)靶標增強子的FOXA1占有率

F ChIP-qPCR確認TET1敲低使靶向增強子的FOXA1結合降低，重要的是，可以通過(guò)伴隨的CD結構域過(guò)表達完全挽救