Epigenetic silencing of microRNA-137 enhances ASCT2 expression and tumor glutamine metabolism

日期：2017-08-23 標簽：Epigenetic,silencing,of,microRNA-137,enhances,ASCT2,expression,and,tumor,glutamine,metabolism

DNA甲基化研究案例（二）

一、調控通路

當DNMT（甲基轉移酶）抑制劑消耗完時(shí)，DNMT結合到靶標基因miR-137的啟動(dòng)子上對啟動(dòng)子DNA進(jìn)行甲基化修飾從而抑制miR-137表達；當DNMT抑制劑存在時(shí)，DNMT不能結合到靶標基因miR-137的啟動(dòng)子上從而使miR-137順利表達，而miR-137會(huì )結合到ASCT2 Mrna的3’-UTR抑制其翻譯為蛋白質(zhì)；ASCT2是谷氨酰胺代謝過(guò)程的關(guān)鍵酶，ASCT2的表達促進(jìn)谷氨酰胺的代謝。

二、實(shí)驗流程

本文中作者分為兩個(gè)部分進(jìn)行闡述：miR-137作用于A(yíng)SCT2 mRNA的3’-UTR抑制ASCT的表達，從而使谷氨酸代謝減弱；甲基化酶結合到miR-137啟動(dòng)子上促進(jìn)DNA甲基化抑制miR-137的表達。（1）作者首先通過(guò)三種方法預測以ASCT2為靶標的microRNA，建立miR-137和miR-122過(guò)表達細胞株檢測ASCT的表達表明miR-137和miR-122過(guò)表達使ASCT2表達降低，然后用WB檢測其他microRNA過(guò)表達后的ASCT2的表達表明處理miR-137和miR-122外其他microRNA均不影響ASCT表達，于是作者又通過(guò)對不同細胞系進(jìn)行miR-137過(guò)表達后檢測ASCT2的表達進(jìn)一步驗證miR-137對ASCT2表達的抑制；為了驗證miR-137對ASCT2的抑制機制，作者通過(guò)3’-UTR熒光素酶實(shí)驗驗證miR-137與ASCT2 3’-UTR結合從而抑制蛋白表達；作者通過(guò)對ASCT2敲低、miR-137敲低和抑制后細胞谷氨酰胺代謝的檢測驗證miR-7通過(guò)抑制ASCT表達來(lái)抑制谷氨酰胺的代謝。（2）作者用CHIP實(shí)驗技術(shù)驗證了甲基轉移酶MECP2、DNMT1和DNMT3B與miR-137啟動(dòng)子上的CpG島結合使其甲基化抑制miR-137的表達，然后檢測MeCP2敲低或5-Aza-CdR處理后的細胞的miR-137的表達和谷氨酰胺的代謝。

三、核心FIGURE

Figure1說(shuō)明的是miR-137作用于A(yíng)SCT2 Mrna的3’-UTR抑制ASCT2的表達，降低谷氨酸代謝。

A、 不同方法預測以ASCT2作為靶標的microRNA。

B、 對miR-137、miR-122過(guò)表達后細胞檢測ASCT2的表達，表明miR-137和miR-122過(guò)表達使ASCT2的表達降低。

C、 對一系列的microRNA過(guò)表達，然后用WB檢測ASCT2的表達，表明只有MiR-137和miR-122過(guò)表達后使ASCT2表達下降。

D、 MiR-137與ASCT2 Mrna 3’-UTR結合位點(diǎn)預測。

E-F、分別用Q-PCR和WB檢測不同細胞系miR-137過(guò)表達后ASCT2的表達，表明miR-137過(guò)表達使細胞的ASCT2表達降低

G、熒光素酶實(shí)驗，檢測miR-137與ASCT2 3’-URT的關(guān)系。

H、ASCT2敲低或miR-137過(guò)表達后檢測谷氨酰胺的消耗。

I、對miR-137抑制后檢測谷氨酰胺的代謝活性，表明miR-137抑制后，谷氨酰胺代謝增強。

Figure2說(shuō)明的是甲基化酶MeCP2、DNMT1、DNMT3B結合到miR-137啟動(dòng)子CpG島使DNA甲基化，抑制miR-137的表達，從而降低谷氨酸代謝。

A、 CHIP實(shí)驗，分別用MeCP2、DNMT1和DNMT3B抗體釣取細胞中與蛋白結合的DNA片段，然后進(jìn)行q-pcr驗證，表明這幾種蛋白結合到miR-137啟動(dòng)子的CpG島。

B、 對MeCP2敲低后檢測miR-137表達，表明MeCP2抑制miR-137的表達。

C、 對MeCP2敲低后檢測ASCT2的表達，表明MeCP2促進(jìn)ASCT2的表達。

D-E、用甲基轉移酶抑制劑5-Aza-CdR處理細胞后檢測miR-137和ASCT2的表達，表明5-Aza-CdR使miR-137表達升高而使ASCT2表達降低。

F-G、MeCP2敲低或用甲基轉移酶抑制劑5-Aza-CdR處理細胞后檢測谷氨酰胺代謝，表明MeCP2降低后谷氨酰胺代謝降低。

本公司可提供的技術(shù)服務(wù)

本公司可進(jìn)行以上類(lèi)似實(shí)驗的實(shí)驗設計及整體實(shí)驗外包項目，包括Q-PCR、Western Blot、Luciferase檢測、CHIP、慢病毒穩轉株的建立（過(guò)表達/敲低），其中的Luciferase檢測、CHIP為本公司主營(yíng)項目。

一、 Luciferase檢測：驗證microRNA與靶標3’-UTR的互作。

將ASCT2 3’-UTR序列構建至載體中報告基因luciferase的后面，通過(guò)過(guò)表達miR-137檢測熒光素酶活性，說(shuō)明了miR-137作用于A(yíng)SCT2 3’-UTR抑制基因表達。

二、CHIP技術(shù)：主要研究蛋白與基因啟動(dòng)子之間的關(guān)系。

利用抗原抗體的特異性識別反應，將與目的蛋白相結合的DNA片段沉淀下來(lái)。后解交聯(lián)，聯(lián)用Q-PCR檢測。本實(shí)驗分別用MeCP2、DNMT1和DNMT3B抗體釣取細胞中與蛋白結合的DNA片段，然后進(jìn)行q-pcr檢測，表明MeCP2、DNMT1和DNMT3B與miR-137啟動(dòng)子的CpG島結合。

參考文獻：J Dong,D Xiao,Z Zhao,et al.Epigenetic silencing of microRNA-137 enhances ASCT2 expression and tumor glutamine metabolism. Oncogenesis,2017,6,e356