DNA甲基化文獻賞析之二： DNA甲基化維持障礙是胚胎干細胞全局去甲基化的主要原因

 圖X 調控通路模型。在血清細胞中，UHRF1通過(guò)H3K9me2染色質(zhì)標記與半甲基化DNA結合而募集Dnmt1到復制灶維持DNA甲基化。血清到2i條件轉換導致5mC的被動(dòng)損失蛋白質(zhì)水平的UHRF1下調和H3K9me2的喪失導致復制灶的募集受損。

    DNA去甲基化動(dòng)力學(xué)可歸因于三種主要途徑:( 1）維持DNA甲基化或復制依賴(lài)性被動(dòng)稀釋?zhuān)?）從頭DNA甲基化，和（3）活性DNA去甲基化，主要通過(guò)DNA羥甲基化（圖1A）。在從血清到2i ESC的轉化期間，維持甲基化組分Dnmt1和Uhrf1，十一十一易位（TET）酶（Tet1，Tet2，和低水平Tet3），Aicda和Tdg，這些都以相似的轉錄水平表達涉及在活性DNA去甲基化中。相反，從頭甲基酶Dnmt3a / b及其調節劑Dnmt3在2i狀態(tài)下被抑制（圖1B）。為了進(jìn)一步了解從血清到2i ESC的轉變動(dòng)力學(xué)，作者在幾個(gè)時(shí)間點(diǎn)確定了它們的DNA甲基化狀態(tài)。首先，通過(guò)液相色譜-質(zhì)譜（LC-MS）（圖1C）以及還原代表亞硫酸氫鹽測序（RRBS）（圖1D）等方法量化5-甲基胞嘧啶（5mC）和5-羥甲基胞嘧啶（5hmC）的總體水平，DNA的去甲基化在培養基替換后（32小時(shí);約兩輪復制）迅速發(fā)生，然后逐漸繼續，達到穩態(tài)14天后水平（圖1C）。而在72小時(shí)內觀(guān)察到5hmC水平的適度增加表明存在TET活性。

圖1 小鼠胚胎干細胞血清轉2i轉化過(guò)程中5mC和5hmC的動(dòng)態(tài)調節

（A）胞嘧啶甲基化/去甲基化循環(huán)的示意圖。指出了不同形式的修飾的CpG二元體和相應的方法。

（B）在血清到2i轉變期間參與DNA甲基化機制的基因的表達水平。

（C）在血清至2i轉化期間通過(guò)LC MS在E14中測量的5mC（上）和5hmC（下）的百分比。

（D）在血清至2i轉化期間通過(guò)EBS中的RRBS測量的5mC甲基化的百分比。 水平條代表中值。

（E）數學(xué)建模的圖形表示。針對從頭甲基化（p1）和維持甲基化（p2）的不同值繪制最小均方誤差（MMSE）。

（F）在血清到2i轉化期間，在E14中從LC-MS獲得的實(shí)際測量（紅線(xiàn)）覆蓋數學(xué)模型預測（虛線(xiàn)）。該表總結了數學(xué)建模的結果，顯示了血清穩態(tài)和2i中p1，p2和p3的估計值。p1，每平均細胞分裂成為半甲基化的未甲基化CpG的比例; p2，每平均細胞分裂完全甲基化的半甲基化CpG的比例;和p3,每平均細胞分裂變成羥甲基化的甲基化CpG的比例

    為了剖析這三種途徑的作用和相對貢獻以及所涉及的各種調節因子，作者使用數學(xué)模型來(lái)預測整個(gè)時(shí)間過(guò)程中的DNA去甲基化。計算了完全甲基化的CpG二元組（mCpG/GpCm），半甲基化的CpG二元組（mCpG/GpC）和未甲基化的CpG二元組（CpG/GpC）的百分比以及羥甲基化的CpGs的水平。來(lái)自TAB-seq數據和RRBS測序，這些輸入值以及來(lái)自L(fǎng)C-MS的全局5mC值用于估計以下參數，這些參數與酶豐度和/或活性成正比并反映轉化為產(chǎn)物的底物量：p1，動(dòng)態(tài)從頭甲基化的比例值; p2，維持甲基化的比例常數;和p3，活性去甲基化（羥甲基化）的比例常數。通過(guò)將數學(xué)模型擬合到5mC數據的若干次迭代，能夠估計具有最低最小均方誤差（MMSE）的E14ESC中血清到2i轉變的常數值（圖1E）。p1，p2和p3反映了三種途徑對觀(guān)察到的DNA甲基化動(dòng)力學(xué)的個(gè)體活性和總體貢獻，并預測維持甲基化顯著(zhù)受損并且觀(guān)察到DNA去甲基化的主要驅動(dòng)因素（圖1F）。

    為了驗證并充分了解單個(gè)DNA甲基化和去甲基化酶在全基因組表觀(guān)遺傳重編程中對血清向2i ESC過(guò)渡的貢獻，作者檢測了對各DNA甲基化機制的成分進(jìn)行敲除后的小鼠胚胎干細胞在血清中幾個(gè)時(shí)間點(diǎn)和從血清到2i ESC過(guò)渡期間的DNA甲基化狀態(tài)（圖2A），并將其與模型的預測進(jìn)行比較。在血清→2i轉換過(guò)程特別比較了缺乏Dnmt1或Uhrf1的胚胎干細胞與對照胚胎干細胞的去甲基化率，并觀(guān)察到去甲基化率增加（圖2B），表明DNA甲基化維持的喪失導致去甲基化率增加。這支持了數學(xué)模型（彩色框中的虛線(xiàn)）的預測，并暗示了2i ESC中DNA甲基化維持的丟失，盡管不是完全丟失。接下來(lái)，比較了缺乏Dnmt3a和Dnmt3b的胚胎干細胞的去甲基化動(dòng)力學(xué)，血清培養的胚胎干細胞中Dnmt3a/b的缺失導致5mC的基因組水平僅略微下降（圖2C），并且DNA去甲基化的動(dòng)力學(xué)未改變。在血清到2i的轉化中的檢測表明從頭甲基化的缺失不是DNA甲基化全局喪失的原因（圖2D）。最后，作者評估了參與活性去甲基化途徑的酶在血清到2i轉化中的貢獻。如模型所預測的，缺乏Tet1 / 2/3，Tdg或Aicda的ESC與其野生型對照顯示出非常相似的去甲基化動(dòng)力學(xué)（圖2E）。由于先前已經(jīng)提出TET驅動(dòng)的氧化作為血清轉2i轉化中去甲基化的潛在驅動(dòng)因素，作者證實(shí)了Tet1 / 2/3敲除（KO）細胞中5hmC的損失（圖2F）。這表明TET酶在血清到2i轉化過(guò)程中活躍地氧化5mC，但對于全局DNA去甲基化來(lái)說(shuō)既不充分也不必要。

圖2 DNA甲基化機制突變體的全球去甲基化動(dòng)力學(xué)

（A）實(shí)驗設計的示意圖。

（B）通過(guò)質(zhì)譜法測量的在血清至2i轉變期間Uhrf1和Dnmt1KO ESC中5mC的水平。

（C）通過(guò)質(zhì)譜法測量的血清培養基中缺失誘導后誘導型Dnmt3a/b KO中5mC的水平。

（D）在血清至2i轉換期間誘導型Dnmt3a/b KO中5mC的水平。

（E）通過(guò)質(zhì)譜法測量的血清至2i轉變期間Tet1/2/3 KO和對照中5mC的水平。

（F）通過(guò)質(zhì)譜法測量的在血清至2i轉變期間Tet1/2/3 KO中和對照的5hmC水平。

    有研究表明血清-2i轉換期間5hmC水平升高以及維生素C（vitC）處理的2i胚胎干細胞中進(jìn)一步顯示TET依賴(lài)性低甲基化，提出了TET蛋白可能有助于去甲基化的可能性。作者在血清到2i轉化期間的幾個(gè)時(shí)間點(diǎn)測定了vitC存在或不存在的情況下 5mC和5hmC的水平（圖3A），并觀(guān)察到vitC處理后5hmC顯著(zhù)增加，這導致加速率去甲基化和進(jìn)一步的全局低甲基化。為了證實(shí)這種效應是TET依賴(lài)性的，檢測了在vitC存在或不存在的情況下Tet1/2 KO細胞中5mC和5hmC的水平（圖3B），表明去甲基化（和羥甲基化）的增加速率取決于TET蛋白的活性。隨后分析了5mC和5hmC在功能不同的基因組區域的分布（圖3C），血清中富含5hmC，并將啟動(dòng)子分為高、中、低CpG密度啟動(dòng)子（分別為HCP，ICP和LCP），在沒(méi)有vitC的情況下，5mC/5hmC水平相對于任何三類(lèi)啟動(dòng)子的變化很小。然而，在存在vitC的情況下，早在4小時(shí)就已經(jīng)明顯轉化5mC至5hm，并且5mC損失的速度與CpG密度相關(guān)并且對于每個(gè)類(lèi)別是不同的。增強子，定義為重疊H3K4me1，H3K27ac和DNaseI超敏反應的元素，在血清胚胎干細胞中顯示10％-40％5mC水平，與之前的研究結果一致，增強子的5mC豐度低，并且遵循類(lèi)似于LCP的動(dòng)力學(xué)?；蚪M的最大部分表現與LCP相似;轉化為5hmC和隨后的擦除非常緩慢（圖3C）。最后，分析了Tet1/2/3 KO細胞中的甲基化,使用k-means聚類(lèi)對基因組中平均DNA甲基化分析（圖3D），這些區域在Tet1/2/3 KO細胞中具有更高的5mC水平，但無(wú)法鑒定與他們相關(guān)的任何顯著(zhù)功能的富集。

圖3 血清-2i胚胎干細胞重編程過(guò)程中TET依賴(lài)的去甲基化動(dòng)力學(xué)

（A）在不存在（藍線(xiàn)）或存在vitC（紅線(xiàn)）的血清至2i轉變期間，通過(guò)LC-MS在E14中測量的5mC（上）和5hmC（下）的百分比。

（B）在不存在（灰線(xiàn)）或存在vitC（綠線(xiàn)）的情況下，在血清到2i轉變期間通過(guò)LC-MS在Tet1/2KO中測量的5mC（上）和5hmC（下）的百分比。

（C）通過(guò)WGBS和TAB-seq在高CpG下測量的從血清（灰色）到2i（綠色）或2i+vitC（橙色）重編程的前32小時(shí)期間5mC（上）和5hmC水平（下）的高CpG啟動(dòng)子（HCP），中CpG啟動(dòng)子（ICP），低CpG啟動(dòng)子（LCP）和增強子。對于每類(lèi)基因組元件，僅考慮在血清中具有5hmC富集的子集。

（D）Tet1/2/3 KO細胞和相應對照細胞（Tet WT）中的平均甲基化水平。使用k均值聚類(lèi)鑒定Tet依賴(lài)性區域。

    通過(guò)數學(xué)模型預測維持甲基化顯著(zhù)受損并且觀(guān)察到DNA去甲基化的主要驅動(dòng)因素（圖1F）。隨后，證實(shí)了Dnmt1或Uhrf1缺失后的快速去甲基化（圖2B），并且還顯示從頭甲基化的喪失不能解釋觀(guān)察到的去甲基化動(dòng)力學(xué)（圖2C和2D）。為了理解這種損傷的機制調節，作者關(guān)注維持性甲基化機制的各個(gè)組成部分，特別是Uhrf1的作用。據報道在原始生殖細胞中，維持甲基化部分受到UHRF1核排除的影響。作者分析了UHRF1和DNMT1在血清和2i中生長(cháng)的ESC中的亞細胞定位（圖4A），沒(méi)有檢測到ESC中UHRF1或DNMT1的任何核排斥。然而，觀(guān)察到2i樣品中UHRF1蛋白的信號強度降低。在對血清到2i轉換的細胞的初始轉錄組學(xué)分析顯示Dnmt3a和Dnmt3b以及催化失活的調節同種型Dnmt3l的表達在2i中顯著(zhù)降低，而Uhrf1 mRNA水平未改變（圖1B）。相反，在2i ESC中，UHRF1蛋白水平顯著(zhù)降低（通過(guò)蛋白質(zhì)印跡3倍;通過(guò)定量質(zhì)譜法2倍）（圖4B-4D），同時(shí)發(fā)現UHRF1在血清和2i ESC中的異質(zhì)表達（圖4C），可歸因于UHRF1的細胞周期依賴(lài)性調節。為了進(jìn)一步證實(shí)UHRF1在蛋白質(zhì)水平受到調節的觀(guān)察，我們構建了具有UHRF1-GFP融合蛋白的組成型過(guò)表達的ESC系，與對內源性UHRF1的觀(guān)察相似，UHRF1-GFP細胞系的熒光激活細胞分選（FACS）分析顯示UHRF1-GFP在血清ESC中表達，但在血清至2i轉化后迅速喪失（圖4E）。

    2i條件下UHRF1蛋白的快速但不完全的丟失，那么其是否損害了復制灶的DNA維持甲基化機制的募集？在缺乏Uhrf1的細胞中的先前實(shí)驗證明，UHMF1的存在對于將DNMT1募集到復制灶是絕對必需的。作者通過(guò)在UHRF1和EdU的共染色計算具有EdU陽(yáng)性病灶的細胞數量，用于UHRF1與復制灶的共定位。雖然UHRF1與血清條件下的大多數細胞中的EdU陽(yáng)性復制灶共定位，但在2i條件下該數量顯著(zhù)降低（圖4F），表明血清到2i轉化中的DNA去甲基化是由于UHRF1將DNMT1募集到復制叉受損而導致DNA甲基化維持受損的結果。

圖4 UHRF1在2i中的蛋白質(zhì)水平受到調節

（A）UHRF1（綠色）和DNMT1（紅色）的細胞定位。DAPI（藍色）標記核。

（B）Western印跡分析。

（C）血清和LT 2i ESC中UHRF1（綠色），DNMT1（紅色）和DAPI（藍色）的免疫熒光染色。

（D）相對于血清ESC，在血清至-2i轉化期間的不同時(shí)間點(diǎn)通過(guò)蛋白質(zhì)質(zhì)譜法（無(wú)標記定量[LFQ]）檢測的UHRF1的蛋白質(zhì)水平。

（E）血清-2i轉化期間ESC中UHRF1-GFP融合蛋白的FACS分析。直方圖顯示轉換期間不同時(shí)間點(diǎn)的GFP信號強度。黑色箭頭表示用于量化GFP +細胞百分比的閾值，如折線(xiàn)圖所示。

（F）在血清，24小時(shí)2i和LT2i ESC中的共定位的復制灶的百分比。來(lái)自血清ESC的圖像顯示兩種定量狀態(tài)的實(shí)例;箭頭表示EdU +復制焦點(diǎn)

    UHRF1的募集依賴(lài)于通過(guò)其SRA結構域識別半甲基化的CpG和通過(guò)其Tudor結構域識別組蛋白3賴(lài)氨酸9的甲基化（H3K9me2）上。H3K9甲基轉移酶G9a的缺失導致全球DNA甲基化的喪失，H3K9甲基化的喪失特別是H3K9me2，是導致全基因組去甲基化的另一關(guān)鍵步驟。檢測發(fā)現血清到2i轉化后H3K9me2水平顯著(zhù)降低（2倍減少）（圖5A，5B）。有趣的是，H3K9me2的丟失很快，并且檢測到H3K9me2的全局水平與血清ESC中的DNA甲基化之間的IF之間的弱相關(guān)性（圖5C），這與H3K9me2依賴(lài)性UHRF1募集在其中起關(guān)鍵作用的觀(guān)點(diǎn)一致。為了解H3K9me2丟失的基因座特異性影響，進(jìn)行了H3K9me2的ChIP-seq分析。為了將H3K9me2的存在與5mC的水平相關(guān)聯(lián)，進(jìn)行H3K9me2染色質(zhì)免疫沉淀，然后進(jìn)行亞硫酸氫鹽測序（ChIP-BS-seq）。與相應的輸入樣品相比，H3K9me2結合的DNA中血清ESC和2i ESC中的5mC水平顯著(zhù)增加（圖5D）。將基因組分成具有高或低H3K9me2富集的區域，發(fā)現H3K9me2高區域的5mC水平顯著(zhù)增加（圖5E）。接下來(lái)在Uhrf1與相應的野生型對照ESC的RRBS文庫在H3K9me2區域上測量5mC水平發(fā)現這些區域以UHRF1依賴(lài)性方式在2i ESC中保留高水平的DNA甲基化（圖5F）。血清到2i轉化過(guò)程中H3K9me2水平是如何調節的？作者通過(guò)質(zhì)譜法的蛋白質(zhì)水平（圖5G）量化關(guān)鍵H3K9甲基化酶和去甲基化酶的mRNA水平，發(fā)現幾種H3K9去甲基化酶，包括KDM3A，KDM3B和KDM4A，在2i條件下特異性地在蛋白質(zhì)水平上調。相反，許多H3K9甲基化酶，例如EHMT1（GLP）和EHMT2（G9A）被下調。

圖5.H2K9me2在2i ESC中迅速減少

（A）血清和2i ESC中H3K9me2的Western印跡分析。

（B）血清和2i ESC中H3K9me2（綠色），5mC（紅色）和DAPI（藍色）的免疫熒光染色。

（C）血清，24小時(shí)2i和LT 2i ESC的免疫熒光染色中H3K9me2和5mC的定量信號的相關(guān)性。

（D）通過(guò)H3K9me2-ChIP-BS-seq測量H3K9me2結合的DNA中的5mC水平

（E）在血清和2i ESC中具有高或低H3K9me富集的區域中的5mC水平。

（F）在E14，Uhrf1 WT和Uhrf1 KO ESC中的血清-2i轉變期間由RRBS在富含H3K9me2的區域測定的5mC的水平。

（G）在血清至2i轉化期間的不同時(shí)間點(diǎn)通過(guò)蛋白質(zhì)質(zhì)譜法檢測的已知H3K9修飾物的相對蛋白質(zhì)水平。