Endogenous miRNA Sponge lincRNA-RoR Regulates Oct4, Nanog, and Sox2 in Human Embryonic Stem Cell Self-Renewal

日期：2017-07-13 標簽：LncRNA-ROR,sponge,miR-145

ceRNA研究案例（一）

（一）調控通路：

在細胞的自我更新過(guò)程中，轉錄因子nanog、sox2和oct4促進(jìn)Lnc-ROR的表達，之后Lnc-ROR作為miR-145的內源性海綿吸附體，促進(jìn)轉錄因子nanog、sox2和oct4的表達。

（二）實(shí)驗流程：

作者首先使用RNA FISH實(shí)驗技術(shù)檢測未分化和分化細胞中的LncROR的表達和分布說(shuō)明LncROR與細胞分化有關(guān)，然后研究LncROR的調控機制。作者用WB實(shí)驗檢測ROR過(guò)表達/敲低后的OCT4等蛋白的表達來(lái)說(shuō)明LncROR對蛋白表達的影響，然后通過(guò)熒光素酶實(shí)驗檢測miR-145與OCT4等mRNA的關(guān)系和miR-145與ROR的關(guān)系。Q-pcr檢測ROR敲低后的miR-145前體和成熟體的表達說(shuō)明ROR對miR-145表達的影響，隨后對miR-145、LncROR敲低檢測OCT4等的表達驗證RNA對靶標的影響。此外，作者通過(guò)檢測OCT4等敲低檢測LncROR的表達和CHIP實(shí)驗來(lái)說(shuō)明OCT4等蛋白促進(jìn)LncROR表達。

（三）核心FIGURE：

Figure2說(shuō)明的是LncRNA ROR通過(guò)與miRNA的海綿吸附作用，促進(jìn)OCT4、Nanog、SOX2的表達。

A、 先用Q-PCR分別檢測OCT4和Nanog敲低后的LncROR的表達，然后用CHIP實(shí)驗檢測與OCT4、Nanog、SOX2結合的DNA片段，結果表明OCT4、Nanog、SOX2結合到LncROR啟動(dòng)子上促進(jìn)LncROR的表達。

B、 分別Q-PCR和WB檢測LncROR過(guò)表達和敲低后的OCT4、Nanog、SOX2的表達，結果表明LncROR與OCT4、Nanog、SOX2的表達正相關(guān)。

C、 miRNA與OCT4、Nanog、SOX2以及LncROR結合能力的檢測，以miR-16-5b為陰性對照，結果表明幾種miRNA與OCT4、Nanog、SOX2、LncROR的結合能力很高。

D、 熒光素酶活性檢測miRNA與OCT4、Nanog、SOX2、LncROR的關(guān)系，結果表明miRNA抑制OCT4、Nanog、SOX2、LncROR的表達活性。

E、 熒光素酶活性檢測miR-145結合LncROR結合的位點(diǎn)。

F、 熒光素酶活性檢測LncROR誘導的OCT4等基因的3’-UTR與miR-145的關(guān)系，結果表明miR-145抑制蛋白的表達，而LncROR會(huì )降低miR-145的抑制作用。

  G-H、Q-pcr檢測miR-145初始轉錄本、miR-145前體和成熟miR-145的表達水平，結果表明LncROR影響miR-145的表達。

  I、通過(guò)miR-145和LncROR的敲低檢測OCT4、Nanog、SOX2，結果表明miR-145負調控OCT4、Nanog、SOX2，LncROR正調控OCT4、Nanog、SOX2。

  J、蛋白FISH，在細胞水平上直觀(guān)檢測LncROR敲低后的下游靶標蛋白的表達。

                  本公司可提供的技術(shù)服務(wù)

本公司可進(jìn)行以上類(lèi)似實(shí)驗的實(shí)驗設計及整體實(shí)驗外包項目，包括q-pcr、WB、慢病毒穩轉株的建立（過(guò)表達/敲低）、luciferase Assay、CHIP、，其中CHIP、luciferase Assay為本公司主營(yíng)項目。

一、CHIP實(shí)驗技術(shù)：CHIP實(shí)驗主要研究蛋白與DNA之間的關(guān)系

用目的基因蛋白抗體釣取與之結合的DNA片段，然后用Lnc-ROR啟動(dòng)子區引物進(jìn)行q-pcr檢測基因啟動(dòng)子區的結合蛋白。本實(shí)驗說(shuō)明在細胞自我更新中OCT4、Nanog、SOX2結合到Lnc-ROR啟動(dòng)子上。

二、熒光素酶活性實(shí)驗（luciferase Assay）：檢測microRNA與靶標基因3'-UTR的關(guān)系。

通過(guò)構建miR-145表達質(zhì)粒和靶標基因3’-UTR熒光素酶報告質(zhì)粒雙轉染細胞株，用LncROR誘導檢測熒光素酶活性，結果明了miR-145抑制蛋白的表達，而LncROR會(huì )降低miR-145的抑制作用。

三、FISH技術(shù)：免疫熒光原位雜交，對細胞中的核酸和蛋白進(jìn)行定性、定位和定量。

分別用幾種蛋白的抗體在細胞水平上直觀(guān)檢測LncROR敲低后的下游靶標蛋白的表達，從FISH結果我們可以直觀(guān)的看出LncROR敲低后，其下游靶標的蛋白表達量明顯增加。我公司在實(shí)驗體系中設置陰性和陽(yáng)性對照。

參考文獻: Yue Wang, Zhenyu Xu, Junfeng Jiang,et al. Endogenous miRNA Sponge lincRNA-RoR Regulates Oct4, Nanog, and Sox2

in Human Embryonic Stem Cell Self-Renewal［J］. Developmental Cell，2013， 25, 69–80