Long noncoding RNA BC032469, a novel competing endogenous RNA, upregulates hTERT expression by sponging mi R-1207-5p and promotes proliferation in gastric cancer

日期：2017-08-08 標簽：Long,noncoding,RNA

一種新的內源性RNA  lncRNA BC032469通過(guò)作為miR-1207-5p

的海綿吸附體促進(jìn)hTERT的表達，促進(jìn)胃癌細胞的增殖

一、 調控通路

當LncRNA BC032469低表達時(shí)，miR-1207結合到hTERT mRNA的3’-URT抑制mRNA翻譯表達蛋白，當LncRNA BC032469高表達時(shí)，LncRNA BC032467作為miR-1207的海綿吸附體解除其對hTERT mRNA翻譯的抑制，從而促進(jìn)hTERT蛋白的表達。

二、 實(shí)驗流程

作者首先對臨床樣本的胃癌組織和癌旁組織進(jìn)行免疫組合檢測hTERT的表達，hTERT在胃癌細胞中高表達，然后用LncRNA微陣列分析篩選出差異表達的lncRNA BC032469，再統計臨床上胃癌病人的存活率與BC032469表達的關(guān)系。作者對LncRNA BC032469的研究分為兩方面：功能和機制的研究。（1）功能實(shí)驗：先建立LncRNA敲低穩定株，然后通過(guò)MTT、克隆形成、流式細胞儀、小鼠體內成瘤成瘤實(shí)驗檢測LncRNA的細胞增殖的作用，另外作者通過(guò)免疫組化檢測hTERT的表達說(shuō)明LncRNA對hTERT表達的影響。（2）機制實(shí)驗：作者先用WB實(shí)驗檢測LncRNA敲低后的hTERT的表達表明LncRNA對hTERT表達有影響，然后通過(guò)熒光素酶實(shí)驗驗證LNcRNA并不影響hTERT啟動(dòng)的活性，表明LncRNA對HTERT表達的影響不是在轉錄水平上的。隨后作者對LncRNA敲低后的microRNA表達譜分析篩選出表達差異的miR-1207，然后通過(guò)熒光素酶實(shí)驗驗證hTERT 3’-urt與miR-1207和LncRNA的關(guān)系，表明LncRNA通過(guò)與miR-1207結合解除miR-1207對mRNA表達的抑制。另外，作者用斑點(diǎn)印跡法檢測miR-1207與hTERT 3’-UTR和LncRNA的結合。作者在最后通過(guò)RNA-FISH的方法在細胞內驗證LncRNA與miR-1207的結合。

一、核心FIGURE

Figure1說(shuō)明的是LncRNA敲低后hTERT表達降低，但不影響啟動(dòng)子活性，同時(shí)miR-1207-5p表達升高。

A、          WB檢測LncRNA敲低后hTERT蛋白的表達，表明LncRNA敲低后hTERT表達降低。

B、           熒光素酶實(shí)驗檢測LncRNA與hTERT基因啟動(dòng)子活性的影響，表明LncRNA不影響啟動(dòng)子活性。

C、           LncRNA與microRNA的結合位點(diǎn)預測。

D、          LNcRNA敲低后檢測microRNA的表達，篩選出差異表達miR-1207。

Figure2說(shuō)明的是LncRNA通過(guò)作為miR-1207的海綿吸附體促進(jìn)Htert的表達。

A、          熒光素酶實(shí)驗，通過(guò)LncRNA敲低，加入miR-1207的反向互補RNA和Htert 3’-UTR的miR-1207結合位點(diǎn)突變檢測熒光素酶活性，表明了LncRNA通過(guò)與miR-1207結合調控Htert 3’-UTR。后圖是用miR-1266作為對照組。

B、           通過(guò)LncRNA敲低，加入miR-1207的反向互補RNA、miR-1266反向互補RNA后檢測Htert的表達，表明了LncRNA通過(guò)與miR-1207結合促進(jìn)Htert的表達。

C、           斑點(diǎn)印跡法檢測miR-1207與hTERT 3’-UTR和LncRNA的結合。

D、          RNA –FISH，用miR-1207-5p和LncRNA探針進(jìn)行免疫熒光原位雜交，對細胞內的miR-1207-5p和LncRNA定位表明兩者出現在細胞的同一位置。

本公司可提供的技術(shù)服務(wù)項目

本公司可進(jìn)行類(lèi)似實(shí)驗的實(shí)驗設計及整體實(shí)驗外包項目，包括WB、慢病毒穩轉株的建立（過(guò)表達/敲低）、Q-PCR、熒光素酶（Luciferase）實(shí)驗、RNA-FISH，其中熒光素酶（Luciferase）實(shí)驗、RNA-FISH為本公司主營(yíng)項目。

一、熒光素酶（Luciferase）實(shí)驗：檢測LncRNA、microRNA與靶標基因3’-UTR的關(guān)系。

本實(shí)驗作者通過(guò)LncRNA敲低，加入miR-1207的反向互補RNA和Htert 3’-UTR的miR-1207結合位點(diǎn)突變檢測熒光素酶活性。結果表明了LncRNA敲低與Htert 3’-UTR組的熒光素酶活性顯著(zhù)下降，添加miR-1207的反向互補序列去結合miR-1207后熒光素酶活性顯著(zhù)增強；Htert 3’-URT的1207結合位點(diǎn)突變與LncRNA敲低組的熒光素酶活性無(wú)明顯變化。表明LncRNA通過(guò)與miR-1207競爭性結合，釋放Htert 3’-UTR，促進(jìn)蛋白表達。

二、RNA-FISH：熒光原位雜交，細胞中RNA的RNA表達的定性、定位或定量分析。

本實(shí)驗作者用RNA-FISH對細胞內的miR-1207和LncRNA兩種RNA進(jìn)行共定位，驗證了miR-1207和LncRNA。我公司在實(shí)驗體系中設置陰性和陽(yáng)性對照。

參考文獻：M-H Lü, B Tang,S Zeng,et al. Long noncoding RNA BC032469, a novel competing endogenousRNA, upregulates hTERT expression by sponging miR-1207-5p and promotes proliferation in gastric cancer［J］. Oncogene,2015, 1 – 11