A Feedforward Regulatory Loop between HuR and the Long Noncoding RNA linc-MD1 Controls Early Phases of Myogenesis

日期：2017-07-28 標簽：ceRNA機制

ceRNA機制研究案例（四）

一、調控通路：

LncRNA MD1上有一段miR-133的前體序列。在細胞分化前，HuR蛋白結合到Lnc-MD1上抑制Lnc-MD1的剪切斷裂，Lnc-MD1作為miR-133的海綿吸附體使miR-133前體序列結合miR-133，解除miR-133對HuR Mrna翻譯的抑制促進(jìn)HuR的表達。在細胞分化時(shí)，Lnc-MD1斷裂釋放miR-133前體使miR-133表達升高，miR-133結合到HuR mRNA的3’-UTR上抑制HuR的表達從而使得Lnc-MD1又可作為miR-133的前體。

二、 實(shí)驗流程：

作者首先進(jìn)行熒光素酶實(shí)驗檢測HuR與Lnc-MD1的關(guān)系以及對Lnc-MD1過(guò)表達和敲低后檢測HuR的表達，表明LncMD1對HuR的促進(jìn)作用。隨后分別用RIP和RNA pull-down來(lái)驗證Lnc-MD1與HuR、Ago2的結合，用RNA-RNA pull-down驗證Lnc-MD1與miR-133結合。然后通過(guò)EMSA實(shí)驗驗證HuR與Lnc-MD1并驗證了與Lnc-MD1的結合位點(diǎn)說(shuō)HuR結合到Lnc-MD1上的miR-133前體序列上。最后作者通過(guò)檢測細胞分化過(guò)程中的Lnc-MD1、miR-133和HuR的表達，以及檢測HuR敲低后的Lnc-MD1的表達，表明HuR抑制Lnc-MD1轉變?yōu)閙iR-133。

三、核心FIGURE：

Figure1說(shuō)明的是Lnc-MD1對HuR蛋白表達的影響。

A-C、熒光素酶實(shí)驗，將HuR mRNA3’-UTR連接到熒光素酶報告質(zhì)粒上與Lnc-MD1表達質(zhì)粒共轉染后檢測細胞的熒光素酶活性。

E、 Q-PCR檢測Lnc-MD1過(guò)表達/敲低，WB檢測Lnc-MD1過(guò)表達/敲低后HuR蛋白的表達。表明Lnc-MD1促進(jìn)HuR的表達。

Figure2說(shuō)明的是HuR與Lnc-MD1結合后，Lnc-MD1作為miR-133的吸附體結合miR-133。

A、 RIP實(shí)驗，用HuR蛋白抗體從小鼠和人的細胞中釣取與HuR結合的RNA，然后進(jìn)行Q-PCR檢測，表明HuR與Lnc-MD1結合。

B、 Ago2-RIP，用Ago2抗體釣取與Ago2蛋白結合的RNA，然后然后進(jìn)行Q-PCR檢測，表明Ago2與Lnc-MD1結合。

C、 RNA pull-down/RNA-RNA pull-down，用Lnc-MD1探針釣取與之結合蛋白和RNA，產(chǎn)物進(jìn)行WB和Q-PCR檢測，表明Lnc-MD1能與HuR、Ago2蛋白結合，也與miR-133高度結合。

D、 EMSA實(shí)驗，用Lnc-MD1探針與HuR進(jìn)行體外結合實(shí)驗，表明lnc-MD1包含miR-133序列區段與HuR結合。

E、 EMSA實(shí)驗，用MD1-133b探針與冷探針進(jìn)行體外結合HuR實(shí)驗，表明兩者具有競爭關(guān)系。

F、 EMSA實(shí)驗，用MD1-133b探針、突變探針和HuR進(jìn)行體外結合實(shí)驗，突變后的MD1-133不與HuR結合。

Figure3說(shuō)明的是HuR對Lnc-MD1和miR-133的影響。

A、 細胞分化過(guò)程中WB檢測HuR，RT-PCR檢測Lnc-MD1，NB檢測miR-133的表達。表明在細胞分化中期（48-72h）HuR和Lnc-MD1表達升高，在分化后期HuR和Lnc-MD1表達下降，而pre-miR-133b和miR-133b的表達升高。

B、 Lnc-MD1作為miR-133前體的示意圖。

C、 Q-pcr檢測HuR敲低后Lnc-MD1、pre-miR-133b和miR-133b的表達，表明HuR敲低后，Lnc-MD1下降，pre-miR-133b和miR-133b升高。

本公司可提供的技術(shù)服務(wù)

本公司可進(jìn)行以上類(lèi)似實(shí)驗的實(shí)驗設計及整體實(shí)驗外包項目，包括q-pcr、WB、慢病毒穩轉株的建立（過(guò)表達/敲低）、luciferase Assay、RIP、Ago2-RIP、RNA pull-down、RNA-RNA pull-down、EMSA、Nortern blot，其中luciferase Assay、RIP、Ago2-RIP、RNA pull-down、RNA-RNA pull-down、EMSA為本公司主營(yíng)項目。

一、   luciferase Assay：檢測microRNA與靶標基因3’-UTR的關(guān)系。

將HuR mRNA上包含miR-133結合位點(diǎn)或miR-133結合位點(diǎn)缺失的3’-UTR連接到熒光素酶報告質(zhì)粒上，然后與Lnc-MD1或Lnc-MD1上133結合位點(diǎn)缺失的表達質(zhì)粒共轉染后檢測細胞的熒光素酶活性。

二、RIP/ago2-RIP實(shí)驗：RIP(RNA 免疫共沉淀)技術(shù)主要研究蛋白與RNA的相互作用。

利用HuR抗體從小鼠細胞和人細胞裂解液中釣取與HuR蛋白結合的RNA，產(chǎn)物進(jìn)行qrt-PCR檢測，結果表明Lnc-MD1與HuR蛋白結合。我公司在實(shí)驗體系中設置陽(yáng)性及陰性對照，進(jìn)一步排除系統誤差。

Ago2-RIP，Ago2是一種與microRNA結合后調控Mrna翻譯的蛋白，本實(shí)驗利用Ago2-抗體釣取與ago2蛋白結合的RNA，產(chǎn)物進(jìn)行Q-PCR檢測，表明Lnc-MD1與Ago2結合。我公司在實(shí)驗體系中設置陽(yáng)性及陰性對照，進(jìn)一步排除系統誤差。

三、RNA pull-down：檢測RNA結合蛋白與其靶RNA之間相互作用的主要實(shí)驗手段之一。

用Lnc-MD1探針釣取與RNA結合的蛋白，然后進(jìn)行WB驗證，表明Lnc-MD1結合Ago2和HuR。

四、 RNA-RNA pull-down：檢測RNA與其靶RNA之間相互作用的主要實(shí)驗手段。

用Lnc-MD1探針釣取與之結合的RNA，產(chǎn)物進(jìn)行Q-PCR檢測，結果表明miR-133與Lnc-MD1高度結合。

參考文獻：Ivano Legnini, Mariangela Morlando, Arianna Mangiavacchi，et al. A Feedforward Regulatory Loop between HuR and the Long Noncoding RNA linc-MD1 Controls Early Phases of Myogenesis. Molecular Cell,2013, 53, 506–514