Lnc RNA HOTAIR functions as a competing endogenous RNA to regulate HER2 expression bysponging mi R-331-3p in gastric cancer

日期：2017-08-08 標簽：Lnc,RNA

LncRNA作為miR-331-3p的海綿吸附體調控HER2的表達

一、   調控通路

當LncRNA HOTAIR低表達時(shí)，miR-331-3p與ago2結合到HER2 Mrna的3’-UTR抑制翻譯；當LncRNA HOTAIR高表達時(shí)，LncRNA HOTAIR競爭性的結合miR-3313p-ago2，使HER2 mRNA的翻譯不受抑制，從而促進(jìn)了HER2蛋白的表達。

二、   實(shí)驗流程

本文旨在說(shuō)明LncRNA HOTAIR結合miR-331-3p后解除其對HER2 mRNA翻譯的抑制從而促進(jìn)HER2蛋白表達。作者首先根據臨床樣本進(jìn)行Q-PCR檢測正常組織細胞核胃癌細胞的LncRNA HOTAIR的表達和存活率與LncRNA HOTAIR表達量關(guān)系的分析篩選出本文的主體LncRNA HOTAIR。再進(jìn)行功能和作用機制兩方面的研究。（1）功能實(shí)驗：通過(guò)建立LncRNA HOTAIR過(guò)表達/敲低穩定細胞株，分別進(jìn)行MTT實(shí)驗、Hoechst染色、流式細胞儀、Transwell、動(dòng)物體內成瘤實(shí)驗驗證LncRNA HOTAIR對細胞增殖，細胞凋亡的影響。（2）機制實(shí)驗：生物信息學(xué)分析表明LncRNA HOTAIR有與microRNA的結合位點(diǎn)，作者通過(guò)熒光素酶實(shí)驗驗證了LncRNA HOTAIR與miR-331-3p的結合，同樣的用熒光素酶實(shí)驗檢測HER2 3’-UTR與miR-331-3P的關(guān)系，然后用Ago2-RIP技術(shù)驗證了LncRNA HOTAIR與miR-331-3p-Ago2結合。最后通過(guò)使用WB檢測LncRNA HOTAIR過(guò)表達/敲低后的HER2蛋白的表達驗證了LncRNA HOTAIR對HER2的促進(jìn)作用。

三、   核心FIGURE

Figure1說(shuō)明LncRNA HOTAIR以miR-331-3p為靶標來(lái)調控HER2的表達。

A、          生物信息學(xué)預測LncRNA HOTAIR與microRNA的結合位點(diǎn)。

B、           熒光素酶實(shí)驗，將連接LncRNA的熒光素酶報告質(zhì)粒與microRNA轉染細胞，檢測熒光素酶活性，結果表明LncRNA HOTAIR與miR-331-3p的熒光素酶活性顯著(zhù)降低，說(shuō)明LncRNA HOTAIR與miR-331-3p高度結合。

C、           熒光素酶實(shí)驗，將HER2 3’-utr連到熒光素酶報告質(zhì)粒上，與LncRNA HOTAIR表達質(zhì)粒共轉染，然后轉染miR-331-3p檢測熒光素酶活性。表明miR-331-3p抑制熒光素酶活性，HOTAIR促進(jìn)熒光素酶活性。

D、          Ago2-RIP，用Ago2蛋白抗體釣取與Ago2-結合的RNA，然后通過(guò)q-pcr檢測表明Ago2結合LncRNA HOTAIR和miR-331-3p。

E、           通過(guò)WB檢測miR-331-3p過(guò)表、HOTAIR敲低和過(guò)表達細胞的HER2的表達，說(shuō)明miR-331-3p抑制HER2表達，而HOTAIR促進(jìn)HER2的表達。

                      本公司可提供的技術(shù)服務(wù)

    本公司可進(jìn)行以上類(lèi)似實(shí)驗的實(shí)驗設計及整體實(shí)驗外包項目，包括q-pcr、WB、慢病毒穩轉株的建立（過(guò)表達/敲低）、luciferase Assay、Ago2-RIP，其中Ago2-RIP、luciferase Assay為本公司主營(yíng)項目。

一、luciferase Assay：檢測microRNA與靶標基因3’-UTR的關(guān)系。

將HER2 3’-utr連到熒光素酶報告質(zhì)粒上，與LncRNA HOTAIR表達質(zhì)粒共轉染，然后轉染miR-331-3p檢測熒光素酶活性。表明miR-331-3p抑制熒光素酶活性，HOTAIR促進(jìn)熒光素酶活性。也就是說(shuō)HOTAIR解除了MiR-331-3p對蛋白表達的抑制。

二、Ago2-RIP：主要研究ago2蛋白與RNA的相互作用

用Ago2蛋白抗體釣取與Ago2結合的RNA，然后通過(guò)q-pcr檢測，結果表明Ago2結合LncRNA HOTAIR和miR-331-3p。我公司在實(shí)驗體系中設置陽(yáng)性及陰性對照，進(jìn)一步排除系統誤差。

參考文獻：Xiang-hua Liu, Ming Sun, Feng-qi Nie,et al. Lnc RNA HOTAIR functions as a competingendogenous RNA to regulate HER2 expression bysponging mi R-331-3p in gastric cancer. Molecular Cancer,2014,13:92