H3K27 acetylation activated-long non-coding RNA CCAT1 affects cell proliferation and migration by regulating SPRY4 and HOXB13 expression in esophageal squamous cell carcinoma

日期：2017-07-14 標簽：Lnc,CCAT1,ceRNA,ago2

ceRNA研究案例（二）

（一）調控通路圖

 在細胞核內，LncCCAT1將PRC2和SUV39H1結合到SPRY4啟動(dòng)子上促進(jìn)啟動(dòng)子組蛋白甲基化，抑制SPRY4的表達；在細胞質(zhì)中，LncCCAT1作為miR-7的內源性海綿吸附體結合miR-7使HOXB13 mRNA翻譯不受miR-7-ago2抑制。

（二）實(shí)驗流程：

       1、LncRNA CCAT1篩選：作者首先通過(guò)食管鱗狀細胞癌和癌旁組織的LncRNA芯片分析篩選出在食管鱗狀細胞癌中高表達的LncRNA CCAT1，然后用QRT-PCR驗證，并且用生物信息學(xué)分析預測與LncRNA CCAT1結合的靶標。

        2、LncRNA CCAT1功能實(shí)驗：構建慢病毒過(guò)表達和敲低穩定轉染細胞株，進(jìn)行MTT、Brdu實(shí)驗檢測LncRNA CCAT1對細胞增殖的影響，另外向小鼠體內注射細胞檢測細胞瘤形成情況。

        3、機制實(shí)驗：機制實(shí)驗分為兩部分

         一是LncRNA CCAT1將EAH2和SUV39H結合到SPRY4的啟動(dòng)子上促進(jìn)啟動(dòng)子組蛋白甲基化，抑制SPRY4基因的表達。作者首先進(jìn)行RNA pull-down和RIP實(shí)驗驗證LncRNA CCAT1與EZH2和SUV39H結合，然后進(jìn)行CHIP實(shí)驗驗證了EZH2和SUV39結合到SPRY4啟動(dòng)子上并促進(jìn)組蛋白H3K9甲基化。最后通過(guò)對LncRNA CCAT1、EZH2、SUV39H的過(guò)表達/敲低后檢測SPRY4的表達。

         二是LncRNA CCAT1作為miR-7的海綿吸附體結合miR-7，解除miR-7對HOXB13 mRNA翻譯的抑制。首先通過(guò)啟動(dòng)子熒光素酶實(shí)驗檢測LncRNA CCAT1與HOXB13啟動(dòng)子的關(guān)系表明LncRNA CCAT1對HOXB13啟動(dòng)子活性無(wú)影響，然后檢測LncRNA CCAT1過(guò)表達/敲低后的miR-7表達，miR-7 mimics的HOXB13的表達。之后進(jìn)行HOXB13的3'-UTR熒光素酶檢測表明miR-7對HOXB13的3'-UTR的作用。最后用RIP實(shí)驗驗證LncCCAT1與miR-7-ago2復合體結合。

（三）核心FIGURE：

Figure1說(shuō)明的是LncRNA CCAT1通過(guò)將EZH2和SUV39H1結合到SPRY4啟動(dòng)子上抑制SPRY4的表達，促進(jìn)細胞增殖。

A、RNA pull-down，用LncRNA CCAT1探針釣取與之結合的蛋白，用EZH2和AUV39H1抗體進(jìn)行WB檢測，結果表明LncRNA CCAT1與EZH2和AUV39H1蛋白結合。

B、RIP實(shí)驗，分別用蛋白抗體釣取與蛋白結合的RNA，結果表明LncRNA CCAT1與蛋白EZH1、AUV39H1結合。

C、CHIP實(shí)驗，分別用SUV39H1和H3K9me3抗體釣取LncRNA CCAT1敲低和過(guò)表達細胞中的結合DNA片段，然后用SPRY4啟動(dòng)子引物進(jìn)行Q-PCR檢測，結果表明LncRNA CCAT1過(guò)表達細胞與敲低細胞相比，過(guò)表達細胞的SUV39H1結合到SPRY4啟動(dòng)子上并且使組蛋白甲基化程度明顯增加。

D、LncRNA CCAT1的過(guò)表達和EZH2、SUV39H1的敲低后，用Q-PCR檢測SPRY4的表達，結果表明只有LncRNA CCAT1過(guò)表達時(shí)SPRY4低表達，而同時(shí)過(guò)表達LncRNA CCAT1和敲低EZH2或SUV39H1時(shí)SPRY4高表達。

E、細胞活性檢測，上圖為SPRY4過(guò)表達的WB檢測，下圖為L(cháng)ncRNA CCAT1的過(guò)表達后抑制SPRY4對細胞增殖的促進(jìn)作用。

Figure2說(shuō)明的是LncRNA CCAT1與miR-7結合下調miR-7，促進(jìn)HOXB13 mRNA翻譯表達。

A、 WB實(shí)驗，檢測LncRNA CCAT1敲低和過(guò)表達細胞的HOXB13表達情況，結果表明LncRNA CCAT1促進(jìn)HOXB13的表達。

B、 熒光素酶檢測LncRNA CCAT1與HOXB13啟動(dòng)子關(guān)系，表明LncRNA CCAT1對HOXB13啟動(dòng)子的轉錄活性無(wú)影響。

C、 Q-PCR檢測LncRNA CCAT1敲低和過(guò)表達的miR-7的表達，結果表明LncRNA CCAT1敲低時(shí)miR-7高表達，LncRNA CCAT1過(guò)表達時(shí)miR-7低表達。說(shuō)明LncRNA CCAT1可能是通過(guò)調控miR-7來(lái)調控HOXB13的表達。

D、 通過(guò)增強miRNA功能檢測HOXB13的表達，結果說(shuō)明miR-7抑制HOXB13的表達。

E、 熒光素酶檢測LncCCAT1、miR-7和HOXB13 3'-UTR的關(guān)系，結果表明LncRNACCAT1、HOXB13 3'-UTR的熒光樹(shù)酶活性均受miR-7下調。

F、 熒光素酶檢測LncCCAT1和HOXB13 3'-UTR的關(guān)系。

G、 RIP實(shí)驗，用ago2抗體釣取與ago2蛋白結合的RNA，q-pcr檢測產(chǎn)物，表明LncCCAT1能結合miR-7-ago2復合體。

H、 檢測LncCCAT1過(guò)表達、miR-7轉染細胞中的HOXB13表達，表明miR-7下調HOXB13，而LncCCAT1抑制miR-7的下調作用。

I-J、細胞活性檢測，表明LncCCAT1通過(guò)促進(jìn)HOXB13表達來(lái)促進(jìn)細胞的增殖和侵染。

我們公司可以提供的技術(shù)服務(wù)

本公司可進(jìn)行以上類(lèi)似實(shí)驗的實(shí)驗設計及整體實(shí)驗外包項目，包括RIP、CHIP、慢病毒穩轉株的建立（過(guò)表達/敲低）、WB、Q-PCR、熒光素酶實(shí)驗、miRNA-mimics，其中RNA pull-down、RIP、CHIP、熒光素酶實(shí)驗為本公司主營(yíng)項目。

一、RNA pull-down：檢測RNA結合蛋白與其靶RNA之間相互作用的主要實(shí)驗手段之一。

用Lnc CCAT1生物素標記探針釣取與RNA結合的蛋白，然后進(jìn)行WB檢測，表明了Lnc CCAT1結合EZH2和SUV39H1，并且EZH2結合在LncRNA的5’端，SUV39H1結合在3’端。

二、RIP實(shí)驗：RIP(RNA 免疫共沉淀)技術(shù)主要研究蛋白與RNA的相互作用

利用相應蛋白抗體，在全蛋白提取液中捕蛋白-RNA復合體，洗脫RNA，反轉錄，qPCR檢測表明了LncCCAT1與SUV39H1、EZH2以及SUZ12高度結合。我公司在實(shí)驗體系中設置陽(yáng)性及陰性對照，進(jìn)一步排除系統誤差。

三、 CHIP實(shí)驗：主要研究蛋白與基因啟動(dòng)子之間的關(guān)系。

利用抗原抗體的特異性識別反應，將與目的蛋白相結合的DNA片段沉淀下來(lái)。后解交聯(lián)，聯(lián)用Q-PCR檢測。本實(shí)驗分別用SUV39H1和H3K9me3抗體釣取DNA片段后用Q-PCR檢測表明SPRY4的啟動(dòng)子結合SUV39H1和H3K9me3蛋白。

四、 螢光素酶活性實(shí)驗（luciferase Assay）：一類(lèi)是檢測轉錄因子和其靶啟動(dòng)子中的特異順序結合，一類(lèi)是檢測miRNA與靶基因3’UTR作用關(guān)系，通過(guò)不同的熒光素酶載體實(shí)現。

          例一：?jiǎn)?dòng)子熒光素酶實(shí)驗

該實(shí)驗驗證的是LncCCAT1與HOXB13啟動(dòng)子之間的關(guān)系，通過(guò)構建CCAT1的RNA干擾轉染細胞株檢測HOXB3啟動(dòng)子活性，以CCAT1非干擾為對照，表明了LncCCAT1對HOXB3啟動(dòng)子活性無(wú)影響。

         例二：3'-UTR熒光素酶實(shí)驗

本實(shí)驗驗證miR-7對HOXB13 3’-UTR作用調控基因表達，實(shí)驗表明miR-7功能增強對靶基因的表達起下調作用，而3’-UTR突變后靶基因表達不受miR-7影響。

參考文獻：Erbao Zhang , Liang Han, Dandan Yin，et al. H3K27 acetylation activated-long non-coding RNA CCAT1 affects cell proliferation and migration by regulating SPRY4 and HOXB13 expression in esophageal squamous cell carcinoma［J］. Nucleic Acids Research, 2016, 10.1093