HMGNs對REX1表達和染色質(zhì)結合特異性的表觀(guān)遺傳調控

圖1.HMGN與染色質(zhì)互作和對Rex1表達影響的模型。染色質(zhì)環(huán)是由位于基因座上游和下游區域兩側的CTCF分子互作形成的，Rex1基因座位于染色質(zhì)環(huán)內。在WT細胞（圖的左側）中，位于5位超級增強子上的NANOG，OCT4和SOX2與Rex1基因的結合促進(jìn)了與近端調控元件的相互作用，從而促進(jìn)了Rex1表達。HMGN的丟失（右側）不會(huì )影響CTCF結合，但會(huì )增加H1的占有率，解除轉錄因子與超級增強子的結合，并降低DNase I敏感性和標記活性染色質(zhì)的組蛋白修飾水平。這些表觀(guān)遺傳學(xué)的變化可以防止Rex1增強子和Rex1近端調節位點(diǎn)之間的接觸，從而下調Rex1的表達。

    作者進(jìn)行LIF / 2i（可使懸浮生長(cháng)的小鼠ESC保持其多能性）去除后的第0、2、4、6天基因表達分析，顯示與WT相比HMGN DKO中176、239、447和592個(gè)基因的表達下降而只有13個(gè)基因始終被下調（圖2A）。表明，在每個(gè)分化階段，HMGNs調節一組獨特基因的表達。在DKO細胞中始終被下調的13個(gè)基因中，作者研究了Rex1（Zfp-42，一種已知會(huì )影響多能性的鋅指蛋白）。Q-pcr顯示Rex1在小鼠胚胎干細胞中高表達，在LIF / 2i去除后的第2天，ESC中Rex1表達被顯著(zhù)下調（圖2B），在HMGNs DKO ESC中，Rex1的表達比野生型ESC中的表達低3倍以上，并且在EB分化的所有6天中，DKO細胞中Rex1的轉錄仍然較低（圖2B和C）。相反，HMGNs的丟失對管家基因如Actb的表達幾乎沒(méi)有影響（圖2D）。WB也證實(shí)DKO中的REX1蛋白水平比WT細胞低50％以上（圖2E）。說(shuō)明Rex1轉錄本的下調歸因于HMGN的丟失。

圖2. HMGN蛋白影響Rex1表達。

（A）維恩圖顯示了在LIF / 2i去除后的不同天，與WT胚胎干細胞相比，DKO中下調基因之間的重疊。圖的外圍顯示了在每個(gè)EB分化階段DKO中表達下調的基因總數（1.3倍； P <0.05）。圖的右邊列出的13個(gè)基因在整個(gè)分化過(guò)程中均被下調。

（B）在LIF / 21退出后指定天數后通過(guò)mRNA-seq分析WT和DKO ESC中Rex1的轉錄水平。（C）3個(gè)生物學(xué)復制的IGV數據，顯示ESC中Rex1的mRNA水平。

（D）IGV顯示Actb的mRNA水平作為對照。

（E）WB檢測ESC中REX1的表達。

   為了了解HMGNs調節Rex1表達的機制，作者首先檢測了HMGNs的丟失是否改變該基因的調控區域的染色質(zhì)結構。通過(guò)HMGN1和HMGN2的ChIP-seq分析顯示在Rex1基因的5個(gè)區域和兩個(gè)富含H3K27ac和H3K4me1的上游區域有較高的HMGN占用率。位于距Rex1基因14 kb處的遠端（圖3中的棕星）顯示出較高的DNaseI相對敏感性，這對應已知的ESC特異性增強子。HMGN的缺失導致DNaseI敏感性以及H3K27ac和H3K4me1水平顯著(zhù)降低（圖2中的箭頭），會(huì )導致基因H3K27ac和H3K4me1（箭頭）以及H3K4me3，H3K9Ac和H2BK5ac在該基因的最接近5區的水平降低（圖3中的虛線(xiàn)框），而這些轉錄活性染色質(zhì)標記的下調不如在遠端超級增強子區域看到的明顯?？傊?，我們對WT和DKO ESC的ChIP-seq分析表明，HMGN蛋白的缺失降低了Rex1調控位點(diǎn)的活性染色質(zhì)標記和DNase I超敏性水平。

圖3. HMGN的缺失改變了Rex1基因座的染色質(zhì)結構。顯示的是IGV，描述了HMGN1和HMGN2的占有率，DNase I超敏性（DHS）以及從WT和DKO小鼠中分離出的ESC的Rex1基因座上所示的組蛋白修飾水平。 黃色列突出顯示了近端（紅星）和遠端（棕星）增強子區域的位置。箭頭指向DKO細胞中DNase1，H2K27ac和H3K4me1的丟失，Rex1基因近端5區的表觀(guān)遺傳變化在虛線(xiàn)框內可見(jiàn)。

已知ESC中Rex1的表達受轉錄因子OCT4，NANOG和SOX2調控。mRNA序列分析表明HMGN蛋白的丟失不會(huì )影響Oct4，Nanog或Sox2的轉錄水平（圖4A），因此HMGN可能是通過(guò)調節轉錄因子的結合來(lái)調節Rex1表達。ChIP-seq分析顯示，位于Rex1基因5處的超級增強子區域（圖4B，棕星）處的所有三個(gè)轉錄因子均具有較高的占有率，而在近端增強子區域則沒(méi)有（圖4B紅星），HMGN的喪失完全消除了OCT4，NANOG的結合，并降低了SOX2與Rex1超級增強劑的結合（圖4A，箭頭）。H1促進(jìn)并穩定染色質(zhì)的縮合，可能降低染色質(zhì)調節位點(diǎn)的活性。為了確定HMGNs是否影響組蛋白H1染色質(zhì)的占有率，用H1抗體ChIP-qPCR （圖4C）。在WT中，與Rex1超增強子重疊的所有三個(gè)區域中H1的占有率明顯低于與相鄰非調節區域重疊的五個(gè)區域中的每個(gè)區域中的占有率（比較圖4D中的藍色條）。HMGN的丟失會(huì )導致Rex1超級增強器中三個(gè)位置的每個(gè)位置的H1占用顯著(zhù)上調（圖4D）。 WT細胞中非調節位點(diǎn)H1的平均占有率與DKO細胞中的相同，但在超增強位點(diǎn)，HMGN的丟失導致H1占有率增加了50％（圖4E）。這解釋了該調控位點(diǎn)轉錄因子占有率降低和活性染色質(zhì)的表觀(guān)遺傳標記的喪失。

圖4. HMGN-H1互作調節轉錄因子與Rex1超級增強子的結合。

（A）mRNA-seq，HMGN的丟失不影響Oct4，Nanog或Sox2的表達。

（B）IGV顯示DKO ESC中Rex1超級增強子的OCT4，NANOG和SOX2結合丟失。紅色和棕色的星星分別表示近端增強子和超級增強子區域的位置。箭頭指向轉錄因子的位置，在底部顯示的這些調控區域中選擇組蛋白標記。

（C）選擇用于組蛋白H1 ChIP-qPCR實(shí)驗的基因組區域。

（D）q-pcr檢測C中所示Rex 1的五個(gè)非調節區域和三個(gè)超級增強器區域中WT和DKO ESC中的H1相對占有率。（E）DKO中Rex1超級增強子的H1占有率升高，但相鄰的非調節染色質(zhì)區域中不變。

   先前的ChIA PET結果揭示了Rex1遠端超級增強子與Rex1啟動(dòng)子之間存在顯著(zhù)互作（圖5A），從而增加了連接這些調控位點(diǎn)的染色質(zhì)環(huán)控制Rex1表達水平的可能性。為了測試這種可能性，作者進(jìn)行3C實(shí)驗分析，并比較了WT和DKO ES細胞中Rex1啟動(dòng)子-增強子的互作。3C文庫的PCR擴增顯示，靶向5個(gè)上游Rex1調控區域產(chǎn)生了一條清晰的條帶，表明調控因子之間的互作頻率很高，相反，相同的引物組不能擴增從DKO細胞生成的3C文庫（圖5C）。 Sanger測序證實(shí)，源自WT文庫的PCR產(chǎn)物由與Rex1增強子和啟動(dòng)子區域相鄰的DNA序列組成（圖5D）?？傊?，ChIA-PET和3C實(shí)驗均表明，在WT細胞的染色質(zhì)中，位于該基因5個(gè)近端區域的Rex1調控位點(diǎn)與位于14kb轉錄起始位點(diǎn)上游以上的遠端超增強子互作，而在缺乏HMGN的DKO細胞中則沒(méi)有。

圖5. HMGN的缺失破壞了Rex1 5調控區的染色質(zhì)互作。

（A）Rex1基因座上染色質(zhì)調節區之間相互作用的ChIA-PET分析。頂部顯示管制區域和所選的組蛋白標記。圖中的每條線(xiàn)表示兩個(gè)基因組基因座之間檢測到的相互作用。

（B）用于檢測Rex1的5個(gè)調控區中的染色質(zhì)互作的3C實(shí)驗示意圖。

（C）使用位于Rex1的5個(gè)調節子區域的引物對3C文庫進(jìn)行PCR擴增得到的DNA片段。

（D）Sanger測序證實(shí)PCR產(chǎn)物對應于位于Rex1的5個(gè)區域中調節位點(diǎn)附近的兩個(gè)區域的連接。