核內RBP控制染色體活性和基因的轉錄

    轉錄控制和染色質(zhì)活性總體上涉及到調節性RNA招募特定的RNA結合蛋白（RBP）的作用。盡管其中涉及多個(gè)RBP，但仍不清楚RBP如何直接作用于染色質(zhì)。作者進(jìn)行大規模的RBP ChIP-seq分析，揭示了人類(lèi)基因組中活躍的染色質(zhì)區域中廣泛存在的RBP。像轉錄因子（TFs）一樣，RBP對基因組中的熱點(diǎn)，尤其是基因啟動(dòng)子，也表現出強烈的偏好，因為它們的關(guān)聯(lián)經(jīng)常與轉錄輸出相關(guān)。聚類(lèi)揭示了TF和RBP之間廣泛的關(guān)聯(lián)，例如YY1（已知的RNA依賴(lài)性TF）和RBM25（參與剪接調控的RBP）。最后通過(guò)HI-C和CHIA-PET分析RBM25的消耗對所有YY1依賴(lài)的活性，包括染色質(zhì)結合，DNA環(huán)化和轉錄。

圖1.核RNA結合蛋白普遍存在于基因啟動(dòng)子中，許多通過(guò)與特定轉錄因子的功能相互作用直接參與轉錄。

    為了廣泛研究RBP在染色質(zhì)水平上的潛在功能，作者根據其細胞核定位、先前的研究結果、結合結構域和功能類(lèi)別等等條件，分別對HepG2和K562細胞中的58和45個(gè)RBP進(jìn)行了系統的ChIP-seq分析，根據分析發(fā)現大部分的RBP表現出與染色質(zhì)的廣泛而特異性的相互作用（圖1A）。在大多數情況下，RBP在HepG2和K562細胞中均表現出強結合力，結合ENCODE注釋的染色質(zhì)狀態(tài)和DNase I超敏位點(diǎn)發(fā)現RBP偏愛(ài)開(kāi)放的染色質(zhì)區域，并且通常為CTCF結合位點(diǎn)和CpG島，所有與染色質(zhì)相關(guān)的RBP普遍偏愛(ài)基因啟動(dòng)子，而不同的RBP表現出對不同啟動(dòng)子的偏好，一些特定的啟動(dòng)子被多個(gè)RBP結合（圖1B）。同時(shí)RBP-染色質(zhì)互作傾向于與活性組蛋白修飾（例如，H3K27ac，H3K4me3和H3K36me3）呈正相關(guān)，而與抑制性H3K9me3標記負相關(guān)（圖1C）?？傮w而言，在顯示出可檢測的染色質(zhì)結合的RBP中30％–40％的具有生化活性的染色質(zhì)區域至少與一個(gè)RBP結合（圖1D）。

    為了全面表征單個(gè)RBP的結合偏好，作者將每個(gè)RBP的ChIP-seq峰分配給了7個(gè)帶有ENCODE注釋的基因組片段，并評估了這些片段中每個(gè)RBP的峰的相對分布（圖1E）。這些數據清楚地表明，活性啟動(dòng)子是RBP的熱點(diǎn)。各個(gè)RBP對每種基因組分割類(lèi)型的相對貢獻如圖1E相對氣泡大小所示，相對于其他RBP，HNRNPK是阻遏區的主要RBP。相反，AGO2在HepG2細胞的轉錄區域富集。有趣的是，三個(gè)RBP XRCC5，HNRNPL和RBM25似乎比其他RBP更普遍地與啟動(dòng)子和增強子相連。

圖2.染色質(zhì)相關(guān)RBP的一般特征

（A）通過(guò)ChIP-seq在HepG2和K562細胞中調查的RBP概述。深藍色，符合ENCODE標準的高質(zhì)量數據；淺藍色，ChIP-seq數據，符合所有其他ENCODE標準；灰色，IP后無(wú)信號富集，盡管通過(guò)蛋白質(zhì)印跡檢測到有效IP；白色，未經(jīng)調查。

（B）一個(gè)典型的基因組區域，紅色和橙色突出顯示的ChromHMM片段分別對應于啟動(dòng)子和增強子。

（C）Circos圖顯示了集體RBP-染色質(zhì)相互作用，DNase I超敏檢測到的開(kāi)放染色質(zhì)區域和HepG2細胞中關(guān)鍵組蛋白修飾事件之間的關(guān)系。

（D）HepG2和K562細胞中與染色質(zhì)相關(guān)的RBP覆蓋單個(gè)組蛋白修飾事件，以及與至少一種生化活性相關(guān)的所有染色質(zhì)區域的累積覆蓋率（紅線(xiàn)）。

（E）RBP在HepG2細胞中特定狀態(tài)的ENCODE注釋的基因組分段中的占有率。R，抑制區域； PF，啟動(dòng)子側翼區； T，轉錄區； CTCF，CTCF結合位點(diǎn)； WE，弱效增強劑； E，增強劑； TSS，轉錄起始位點(diǎn)/啟動(dòng)子。

    啟動(dòng)子是RBP-染色質(zhì)相互作用的主要位置，作者進(jìn)一步研究單個(gè)RBP的啟動(dòng)子結合情況。發(fā)現RBP共同優(yōu)先結合用H3K4me3和H3K27me3標記的二價(jià)啟動(dòng)子以及單獨H3K4me3修飾的活性啟動(dòng)子和CpG，不同的是在HepG2細胞中，二價(jià)基因比僅H3K4me3基因更為普遍，在K562細胞中則相反（圖2A），這表明染色質(zhì)相關(guān)的RBP可能積極參與細胞類(lèi)型特異性基因表達程序。關(guān)于在不同類(lèi)別基因的啟動(dòng)子，相對于蛋白質(zhì)編碼和lncRNA基因的啟動(dòng)子，四個(gè)RBP（即RBM22，PRPF4，HNRNPUL1和SNRNP70）在小RNA基因的啟動(dòng)子上表現出額外的富集（圖2B）。此外，PRPF4在tRNA基因啟動(dòng)子上高度富集，SNRNP70在小核仁RNA（snoRNA）基因啟動(dòng)子上高富集（圖2C）。

   圖4D表示了RBP ChIP-seq峰相對于轉錄起始位點(diǎn)（TSS）的位置，盡管所有RBP在TSS的兩側均顯示結合，但出現三類(lèi)明顯的RBP-染色質(zhì)相互作用：（1）上游TSS（即RBM25），（2）以TSS為中心（即，GTF2F1）和（3）下游TSS（即RBFOX2），第三類(lèi)代表兩種細胞類(lèi)型中的大多數RBP（圖2D）。 GTF2F1以TSS為中心的結合模式很可能反映出其作為核心轉錄機制的一部分的功能，暗示具有類(lèi)似關(guān)聯(lián)模式的其他RBP可能具有相關(guān)功能。大多數RBP與TSS下游序列的關(guān)聯(lián)表明，許多RBP可能以新生的RNA依賴(lài)性方式與染色質(zhì)相互作用。

圖3.不同啟動(dòng)子類(lèi)別上的RBP-染色質(zhì)互作模式

（A）通過(guò)序列背景（帶有或不帶有CpG島）或組蛋白修飾特征（例如以H3K4me3和H3K27me3信號標記的二價(jià)啟動(dòng)子）分離的啟動(dòng)子亞組的總體RBP偏好性，僅包含H3K4me3或H3K27me3信號的啟動(dòng)子。正確：相對豐富的關(guān)鍵。

（B）在不同類(lèi)別的基因啟動(dòng)子上各個(gè)RBP的相對占用頻率。

（C）相對于背景分布，六類(lèi)小RNA基因啟動(dòng)子之間的RBP ChIP-seq峰分布。

（D）TSS周?chē)膹秃蟁BP綁定信號。 RBP根據信號最大值與TSS的相對位置進(jìn)行排序。

由于RBP與基因啟動(dòng)子的聯(lián)系緊密，作者接下來(lái)通過(guò)檢測每個(gè)RBP-啟動(dòng)子互作與基因轉錄之間的關(guān)系，通過(guò)RNA-seq比較了每個(gè)RBP敲除之前和之后基因表達的變化。在敲除之前，大多數RBP-啟動(dòng)子互作與靶基因的轉錄活性相關(guān)（圖3A，左），在敲除后，幾乎所有RBP都影響基因表達（圖3A，中間），這些RBP中至少有六個(gè)對轉錄有直接影響（圖3A，右）。為了確定誘導的基因表達是否與其啟動(dòng)子結合相關(guān)，作者進(jìn)一步計算了每個(gè)RBP的優(yōu)勢比，這六個(gè)RBP均顯示出明顯的優(yōu)勢比（> 1，p <0.05），表明這些RBP直接參與轉錄控制（圖3B）。另外，作者在GRO-seq和RNA-seq信號之間進(jìn)行了比較，觀(guān)察到在穩態(tài)下轉錄相對于RNA水平的總體變化的三種不同模式：對于HNRNPLL，在敲除后觀(guān)察到RNA-seq和GRO-seq之間幾乎沒(méi)有一致性（圖3C，頂部），表明該RBP可能獨立調節轉錄和轉錄后事件。對于RBM25有正相關(guān)，表明RBM25介導的轉錄在穩態(tài)下可能有助于RNA水平（圖3C，中間）。相反，檢測到與XRCC5呈負相關(guān)（圖3C，底部）。

由于啟動(dòng)子結合可能會(huì )指導下游RNA加工事件，例如RNA穩定性，輸出或翻譯。為此，作者進(jìn)行HepG2細胞中的細胞分級測序（CeFra-seq）和RBP敲低誘導的剪接變化（通過(guò)“剪接百分比”或“ PSI），確定與RBP染色質(zhì)結合活性相關(guān)的功能性。觀(guān)察到mRNA的核保留與在基因啟動(dòng)子處檢測到的RBP數量成反比（圖3D），編碼和非編碼基因均是如此。另外還發(fā)現，不同的RBP對這種效果的貢獻不同（圖3E）。特別是，RBM25的啟動(dòng)子締合活性最能預測核保留（圖3F）。

圖4. RBP-啟動(dòng)子相互作用與基因表達之間的相關(guān)性

（A）RBP與啟動(dòng)子結合的概率與GRO-seq鑒定的靶基因轉錄活性之間的相關(guān)性（左）； RNA-seq（中），GRO-seq（右）對單個(gè)RBP敲低的反應。

（B）由GRO-seq確定的RBP占用的啟動(dòng)子與非占用啟動(dòng)子相比的轉錄反應的幾率。

（C）敲低三個(gè)代表性RBP時(shí)，RNA-seq和GRO-seq分析的基因表達變化之間的比較。

（D）其啟動(dòng)子被不同的RBP占據的每組基因的RNA核保留指數（核/（核+胞質(zhì)））的分布。

（E）由隨機森林算法確定的變量重要性，以評估每個(gè)變量的預測能力，顯示了前十個(gè)RBP。

（F）具有或不具有RBM25結合在其啟動(dòng)子上的證據的基因的RNA核保留分布

    為了了解RPB可能如何影響轉錄，RBP-染色質(zhì)互作如何與特定的TF相互協(xié)調。作者將RBP ChIP-seq數據與TF的ChIP-seq數據進(jìn)行了整合，并通過(guò)使用新開(kāi)發(fā)的非負矩陣分解（NMF）方法分析了它們的共共結合。通過(guò)分析找到了17個(gè)最佳組號（圖4A）。根據ENCODE注釋?zhuān)@些因子組中的每一個(gè)都顯示出對不同基因組區域的特定偏好（圖4B）。已知CTCF，RAD21和SMC3這3種蛋白在介導長(cháng)距離基因組相互作用中相互協(xié)作，分析發(fā)現這些蛋白質(zhì)都主要位于HepG2細胞中富含CTCF的基因組片段中（圖4B），這與已知的一致。當前分析的RBP可以其中一組（第10組）僅由RBP組成（圖4C），每組中的多個(gè)因素都在蛋白質(zhì)水平上發(fā)生物理相互作用（圖4C中的藍色邊緣）。通過(guò)根據人類(lèi)基因組HOT區域中峰的比例對RBP進(jìn)行排名并將其分為四個(gè)升四分位數，發(fā)現第4組中超過(guò)一半的RBP與各種TF一起排在了前四分位數中，包括PRPF4， SRSF4等（圖4D）。因此，與TF一樣，RBP也顯示出對人類(lèi)基因組中HOT區的高度偏好。

   在互作網(wǎng)絡(luò )分析中，TF YY1分為兩個(gè)獨立的聯(lián)合組：第9組，包含多個(gè)TF和RBP NONO，是參與RNA加工，DNA修復和重組的多功能核蛋白；第13組，由YY1，XRCC5和RBM25（圖4C）組成，已知前兩者彼此互作。YY1基因組結合位點(diǎn)在HepG2細胞中也表現出RBM25結合（圖4E，上圖），鑒于最近發(fā)現YY1似乎以依賴(lài)RNA的方式與DNA相互作用，RBM25可能以細胞類(lèi)型特異性方式在調節YY1的轉錄功能中發(fā)揮作用。為了探索這種可能性作者分別分析了RBM25和YY1結合圖譜與TSS周?chē)腨Y1結合基序分布的關(guān)系（圖4E，底部），觀(guān)察到核心YY1結合基序在YY1和RBM25共結合的啟動(dòng)子區域富集或單獨的YY1結合，但不是單獨的RBM25結合，表明核心YY1結合基序介導YY1結合。

圖5. HepG2細胞中與染色質(zhì)相關(guān)的RBP和TF的綜合分析

（A）通過(guò)NMF推斷的系數矩陣將染色質(zhì)相關(guān)的RBP和TF分為17組。

（B）由單個(gè)NMF組（左）覆蓋和注釋總的順式調控元件（CRE，在圖1E中定義）。未注釋的區域。右側顯示了每個(gè)組所占的不同CRE的分數。

（C）代表NMF隔離的團體。藍線(xiàn)，由GeneMANIA注釋的每個(gè)組中成員之間的已知物理相作用。

（D）RBP與HOT區域的優(yōu)先關(guān)聯(lián)?；赗BP在HOT啟動(dòng)子區域中的相對結合，它們被分為四個(gè)四分位數（灰色系）。 y軸：落入HOT區域的總峰的百分比。

（E）頂部：Rep25，XRCC5和YY1在HepG2細胞中的共定位。韋恩圖的每個(gè)部分被進(jìn)一步量化為每個(gè)RBP的峰的百分比，基于此可計算出單獨的成對共定位。下圖：相對于YY1，RBM25和YY1結合峰的核心YY1結合基序的分布。

    為了追蹤RBM25在介導YY1依賴(lài)性轉錄中的潛在功能，作者首先驗證了RNA依賴(lài)性YY1在染色質(zhì)上的結合。我們從ENCODE數據中選擇了多個(gè)在HepG2細胞中顯示YY1結合峰的基因啟動(dòng)子，并用5,6dichloro-1-β-D-核呋喃糖基-苯并咪唑阻止轉錄然后對YY1和RBM25進(jìn)行了ChIP-qPCR，在DRB處理后，所有靶基因座上的YY1和RBM25結合都減弱了，在DRB洗脫后恢復了（圖5A，5B）。接下來(lái)通過(guò)coIP 實(shí)驗驗證YY1和RBM25形成復合物（圖5C）。siRNA介導的YY1或RBM25耗竭對每種蛋白質(zhì)的特異性敲除作用，但對非靶向蛋白質(zhì)卻沒(méi)有作用（圖5D）。細胞的GRO-seq分析結果顯示出高度可重復的模式：在每種情況下均鑒定出大量上調或下調的基因，如圖5E所示。GRO-seq信號的倍數變化（FC）之間的比較顯示YY1和RBM25敲低誘導的基因表達之間存在一致性。由于每種因子的敲低都會(huì )導致大量基因的下調和上調，因此在通常受影響的基因中，絕大多數上調和下調的基因在相同方向上受到影響（圖5G）。此外，RBM25或YY1敲低的基因上調和下調都與它們的啟動(dòng)子關(guān)聯(lián)，如在所有成對比較中均具有很高的比值比（圖5H）。

圖6（A+B） YY1和RBM25在HepG2細胞（A和B）中對基因表達的共調控ChIP-qPCR分析了DRB處理后和DRB洗脫后結合在代表性靶基因啟動(dòng)子上的YY1（A）和RBM25（B）。

（C）RBM25和YY1的相互coIP。 

（D）RBM25或YY1的有效敲低而不影響其他蛋白質(zhì)。

（E）在兩個(gè)代表性基因位點(diǎn)上的RBM25和YY1 ChIP-seq譜圖，一個(gè)通過(guò)GRO-seq確定，一個(gè)用于上調（左）基因，一個(gè)用于下調（右）基因。

（F）對RBM25和YY1敲低的轉錄反應的整體比較。標明了倍數變化（FC）的斯皮爾曼相關(guān)系數（SCC）。

（G）在耗盡了RBM25或YY1的HepG2細胞中差異表達的基因的重疊。彩色框和線(xiàn)型分別表示由RBM25（實(shí)線(xiàn)）或YY1（虛線(xiàn)）調節的向上（紅色框）或向下（藍色框）基因表達事件。

（H）靶基因啟動(dòng)子處的RBM25和YY1結合與通過(guò)比值比確定的誘導基因表達正相關(guān)。

    為了了解YY1和RBM25協(xié)調結合和調控轉錄的機制，首先在以YY1和RBM25為靶標的啟動(dòng)子的同一面板上進(jìn)行ChIP-qPCR，發(fā)現RBM25敲低顯著(zhù)降低了所有六個(gè)靶基因上的YY1結合（圖6A），但反之則沒(méi)有（圖6B）。這些結果表明RBM25首先作用于那些靶啟動(dòng)子，這是隨后的YY1結合所必需的。為了獲得對此的整體證據，作者分別在耗盡RBM25之前和之后對YY1進(jìn)行了ChIP-seq，在耗盡YY1之前和之后對RBM25進(jìn)行了ChIP-seq，大多數（即使不是全部）YY1結合事件在RBM25耗盡后減少，但是RBM25 ChIP-seq信號在YY1耗盡后基本上保持不變（圖6C）。對啟動(dòng)子，增強子和CTCF結合位點(diǎn)上的RBM25 ChIP-seq信號的元基因分析表明，RBM25 ChIP-seq信號對YY1耗盡基本不敏感（圖6D）。YY1 ChIP-seq信號在RBM25相關(guān)的基因組位點(diǎn)更為普遍，而RBM25的耗盡顯著(zhù)減弱了所有三類(lèi)DNA元件上的YY1結合（圖6E）。統計分析表明，與沒(méi)有RBM25關(guān)聯(lián)的證據相比，YY1結合中的FC對RBM25占據的基因組位點(diǎn)的影響更大（圖6F）。這些數據表明，RBM25是在HepG2細胞中有效靶向全基因組的YY1所必需的。

    那么RBM25如何調節此類(lèi)YY1介導的基因組互作。作者在敲除RBM25之前和之后在HepG2細胞上進(jìn)行了BL-Hi-C測序和雙末端標簽測序（ChIA- PET）。發(fā)現，RBM25敲減誘導的啟動(dòng)子錨定PET的整體變化略有減少（圖6G），這可能反映了RBM25耗竭對轉錄的直接和間接影響。使用類(lèi)似于然后在處理來(lái)自YY1缺失的mESC的HiChIP數據時(shí)的嚴格性，并著(zhù)眼于顯著(zhù)差異的啟動(dòng)子-增強子相互作用的變化。發(fā)現，與啟動(dòng)子/增強子（PE）連接的PET在人類(lèi)基因組中所有帶注釋的啟動(dòng)子之間在兩個(gè)方向上都顯示出相似的變化（圖6H）。與共結合的啟動(dòng)子和增強子相比，單獨與YY1結合的啟動(dòng)子和增強子顯示出更弱的變化（圖6H）?？傮w而言，這些數據通過(guò)調節YY1募集和YY1介導的基因組相互作用證明了RBM25在YY1依賴(lài)性轉錄中的作用。

圖7.人類(lèi)基因組中的RBM25依賴(lài)性YY1結合

（A和B）敲除其他因子后，YY1（A）和RBM25（B）與代表性靶基因啟動(dòng)子結合的ChIP-qPCR分析。 

（C）具有代表性的基因組位點(diǎn)，顯示下調的YY1結合（ChIP-seq）和YY1介導的染色質(zhì)環(huán)化（BL-Hi-C），以及下（上）-/上（下）調控的基因表達數字：敲除RBM25時(shí)通過(guò)GRO-seq在個(gè)別條件下測得的表達水平。陰影區域突出顯示了靶基因啟動(dòng)子（綠色）與其增強子（藍色）之間相互作用的降低。 

（D和E）RBM25（D）或YY1（E）啟動(dòng)子（左），增強子（中間）和CTCF結合位點(diǎn)（右）上ChIP-seq信號的有基因分析，有或沒(méi)有YY1（D）或RBM25（E）綁定以及YY1（D）或RBM25（E）敲除之前（藍色）或之后（紅色）。

（F）RBM25耗竭對所有基因組位點(diǎn)上有或沒(méi)有RBM25占用證據的YY1結合的影響的統計分析。

 （G）使用所有帶注釋的啟動(dòng)子作為錨點(diǎn)，將RBM25敲低后歸一化PETs頻率的log2倍變化相對于對照樣品中歸一化PETs頻率作圖。突出顯示了與YY1結合的啟動(dòng)子，其相互作用顯著(zhù)增加（紅色）或減少（藍色）。

（H）基因啟動(dòng)子分為四個(gè)不同的類(lèi)別，并分別分析了在RBM25敲除之前和之后，它們與活性增強子的相互作用。歸一化PET頻率的log2倍變化的分布顯示為箱線(xiàn)圖（請參見(jiàn)“方法詳細信息”）。 P，啟動(dòng)子； E，增強劑。核內RBP控制染色體活性和基因的轉錄