轉錄因子Tox2通過(guò)調節染色質(zhì)的可及性驅動(dòng)T濾泡輔助細胞的發(fā)育

作者首先分析了幾個(gè)數據集表明Bcl6在Tfh分化過(guò)程中直接驅動(dòng)Tox2表達（補充數據）。為了弄清Tox2是否在Tfh細胞中選擇性表達，作者分析Tox2基因座的表觀(guān)遺傳學(xué)特征，發(fā)現它在Tfh細胞中被活性染色質(zhì)標記H3K4me3標記而沒(méi)有被抑制性色氨酸標記H3K27me3標記，而在體外和非Tfh細胞或其他T細胞譜系中則相反（圖1A）。小鼠的Tfh細胞進(jìn)行ATAC-seq分析表明與原始CD4 + T細胞相比，Tfh中Tox2基因座染色質(zhì)可及性增加（圖1B）。為了確認Tox2在Tfh細胞中選擇性表達，對CD4 + CD44lo，non-Tfh，pre-Tfh和Tfh細胞進(jìn)行了分類(lèi)并通過(guò)qRT-PCR檢測，發(fā)現Tox2的mRNA水平在CXCR5hiBcl6-RFPhi Tfh細胞中高表達（圖1C），并且與Cxcr5，Bcl6和Pdcd1緊密相關(guān)（圖1C）。另外補充數據中qRT-PCR結果顯示IL-6和IL-21在明顯誘導Tox2表達，而IL-21阻斷可增強Tox2表達，在Stat3或者Bcl6缺乏時(shí)Tox2 mRNA表達都降低。說(shuō)明IL-6和IL-21誘導Tox2表達同時(shí)依賴(lài)于Stat3和Bcl6。

（1）Tox2的表達促進(jìn)Tfh分化（圖略）

已有研究顯示Tox2可以促進(jìn)人NK細胞中Tbx21的表達，為了驗證Tox2在CD4 + T細胞中是否具有相似的功能，作者構建了Tox2過(guò)表達的CD4 + T細胞，然后在中性和Th1分化條件下對細胞進(jìn)行分選和培養。顯示Tox2過(guò)表達使得Bcl6以及其他與Tfh相關(guān)的基因（包括Cxcr5，Il6st和Tcf7 ）mRNA及蛋白質(zhì)表達大量增加。然后，通過(guò)將Tox2轉導的細胞或其對照細胞轉移到受體小鼠中進(jìn)行體內通過(guò)CFA中的雞卵清蛋白（OVA）免疫進(jìn)行免疫分析，表明Tox2轉導的細胞中的Tfh細胞的頻率顯著(zhù)增加，而且相應的Tfh分化分子CXCR5，PD-1和Bcl6的表達增強。

（2）Tox2調節Tfh相關(guān)基因的轉錄

為了深入了解Tox2調節Tfh分化的機制，作者進(jìn)行了RNA-seq分析。與Th0條件相比，在Tfh中2,913個(gè)基因的表達變化超過(guò)1.5倍，Tox2過(guò)表達細胞在Th0和Tfh條件下，分別有1,605和1,311個(gè)基因的表達改變了1.5倍以上（圖3A）。然后，作者選擇在Tfh細胞中差異表達的已發(fā)表基因進(jìn)行基因集富集分析（GSEA）。首先評估了IL-6信號在Tfh發(fā)育過(guò)程中的作用，并觀(guān)察到Tox2-RV-GFP + CD4 + T細胞對Tfh細胞中促進(jìn)的基因組顯著(zhù)富集（圖3B），在Tfh細胞中受阻的基因在空對照細胞中更富集。通過(guò)不同的表達基因（DEG）和GSEA分析，Tox2促進(jìn)了許多Tfh標志基因（Bcl6，Cxcr5，Pdcd1等）的表達，并抑制了許多在Tfh細胞中被抑制的基因（Gzmb，IL2ra等）的表達（圖3C）。同時(shí)，Th1相關(guān)基因（Il12rb2和Tbx21）和Th17相關(guān)基因（Il17a，Il17f，Ahr和Rorc）在Th0和Tfh樣條件下mRNA表達中也被Tox2抑制（圖3C）。

 為了確定Tox2是否直接調節上面的基因，作者通過(guò)ChIP-seq檢測了Tox2靶基因，確認了4,628個(gè)Tox2結合峰，其中分別有46％、24.6％和35.4％的內含子、啟動(dòng)子和遠端基因間區域富集（圖3D）。比較顯示，在2908個(gè)Tox2結合基因中，有336個(gè)受Tox2轉錄調控，包括Bcl6，Cxcr5，Tcf7和Il2ra（圖3E）。在Tfh標志基因（Bcl6，Cxcr5，Pdcd1和Batf）和炎性標志基因（Il2ra，Tbx21，Rorc，Il2和Il17a）中發(fā)現Tox2結合峰（圖3F）。為了確認結果，作者使用表達Tox2：HA的細胞對Bcl6和Cxcr5基因座進(jìn)行了ChIP-qPCR分析證明了Tox2結合（圖3G）。此外，ATAC-seq發(fā)現Tox2結合位點(diǎn)與Tfh細胞中的可及區域相關(guān)（圖3F），從而驗證了Tox2在Tfh細胞中的功能。接下來(lái)，結合了三個(gè)數據集確定了共有59個(gè)直接受Tox2調控的基因，將這些基因與Bcl6靶標（74個(gè)基因）和Ascl2靶標（44個(gè)基因）進(jìn)行比較發(fā)現Tox2、Bcl6和Ascl2僅共同激活了Slc9a9和Tcf7這兩個(gè)基因，其中TCF-1（ Tcf7）被證明是Tfh細胞生成的關(guān)鍵調控因子（圖3H）。Tox2和Bcl6可以抑制Th1相關(guān)的Ahr、Nek6、Socs2、Ncs1和Chd7基因表達，而Tox2和Ascl2可以抑制Th1相關(guān)的Tbx21、Il2ra和Ifitm3基因表達而Cxcr5表達上調（圖3H），表明在Tfh發(fā)育過(guò)程中Tox2與Bcl6和Ascl2協(xié)同作用。

 （3）Tox2功能促進(jìn)染色質(zhì)重塑

由于Tox2包含與DNA結合并可能改變染色質(zhì)構象的高遷移率族（HMG）盒，因此作者假設Tox2編程CD4 + T細胞中的染色質(zhì)重塑以促進(jìn)Tfh細胞發(fā)育。通過(guò)ATAC-seq分析發(fā)現在Tfh與原始CD4 + T細胞之間存在超過(guò)26,000個(gè)區域的差異（圖4A）。在Th0條件下或在培養基中激活的被GFP病毒感染的T細胞，只有839個(gè)差異區。當Th0添加IL-6來(lái)形成類(lèi)似Tfh的條件時(shí)，改變了2071個(gè)區域，其中Bcl6，Tcf7，Ror3和Il23r基因座更易獲得，而Il7r和Socs2基因座則更少。當Tox2過(guò)表達時(shí)，在Th0和Tfh條件下可分別8,700和13,000多個(gè)區域（圖4A）。因此，在Th0和Tfh條件下，阻斷IFNg，IL-4和IL-2會(huì )降低整體染色質(zhì)的可及性，而Tox2的表達會(huì )增加CD4 + T細胞中可及區域的數量。

數據顯示3,546個(gè)元素在染色質(zhì)可及性方面有所提高，包括Bcl6，Cxcr5和Pdcd1位點(diǎn)，在Tox2過(guò)表達后Tfh細胞中只有121個(gè)基因組位點(diǎn)關(guān)閉（圖4B和4C），在Th0和Tfh條件下培養的T細胞中，Bcl6，Cxcr5，Pdcd1和Tcf7區域也更容易接近（圖4D）。接下來(lái)，作者探索Tox2如何影響TF的活性，分析顯示，當在激活的T細胞中阻斷IFNg，IL-4和IL-2時(shí)，Stat1，Stat3，Stat4，Stat5和Stat6結合基序的富集減少（圖4E），IL-6信號傳導增加了AP-1家族和與Tfh或Th17相關(guān)的TF（例如Batf和Stat3）的活性（圖4E）。同時(shí)，在Th0和類(lèi)似Tfh的條件下，Tox2過(guò)表達后結合力下降，其中Bach2，Prdm1和Stat5負調控Tfh分化（圖4E）。這些數據表明Tox2在Tfh分化過(guò)程中直接調節染色質(zhì)的可及性。

為了確定Tox2在Tfh分化中的重要性，作者通過(guò)CRISPR / Cas9在保守的外顯子3中刪除了14個(gè)堿基對，產(chǎn)生移碼突變和所有同工型的翻譯提前終止，證實(shí)Tox2缺陷型CD4 + T細胞的內在缺陷會(huì )影響Tfh分化。同樣的發(fā)現Tox2缺陷型OT-II細胞顯示出Tfh分子CXCR5，PD-1，Bcl6，Ascl2，Bcl6，Cxcr5和Pdcd1的表達減少，但Il7r mRNA表達增加?？紤]到Tox家族除Tox2之外還具有Tox，Tox3和Tox4成員，它們在Tfh細胞分化中是否具有任何冗余功能？首先檢測了Tox，Tox3和Tox4的mRNA表達水平，發(fā)現Tox2缺陷OT-II中Tox和Tox3（幾乎沒(méi)有表達）表達有所增加但Tox4在這些細胞中的表達下降，這表明Tox在具有Tox2的Tfh細胞中可能具有功能冗余。此外，我們通過(guò)檢測Tfh細胞Tox  mRNA的表達證實(shí)了Tox在Tfh細胞中的高表達，這通過(guò)流式細胞術(shù)實(shí)驗得到了證實(shí)。

為了研究Tox在Tfh發(fā)育中的作用，在CD4 + T細胞中進(jìn)行了Tox過(guò)表達，發(fā)現Tox在Th0和類(lèi)似Tfh的培養條件下均能促進(jìn)Bcl6，Ascl2，Cxcr5，Pdcd1，Il6ra，Il6st，Tcf7和Tox2 mRNA表達，表明Tox也可能促進(jìn)Tfh的發(fā)育。然后，通過(guò)將Tox轉導的OT-II細胞轉移到Tcrbd /受體小鼠中，發(fā)現Tox的過(guò)表達在第7天顯著(zhù)增加了Tfh細胞的百分比。同時(shí)，Tcrbd /小鼠中的GC B細胞也明顯增加。在mRNA水平上，Tox轉導的OT-II細胞具有更高的Ascl2，Bcl6，Cxcr5和Pdcd1表達。這些數據表明Tox2和Tox都參與促進(jìn)Tfh發(fā)育。