染色質(zhì)開(kāi)放性分析揭示了TEAD1作為人膠質(zhì)母細胞瘤中的遷移調節因子

作者為了對GSCs與NSPCs細胞中染色質(zhì)開(kāi)放性進(jìn)行研究，利用CD24/34/45-PE抗體通過(guò)流式細胞術(shù)從神經(jīng)膠質(zhì)瘤（GBM）與神經(jīng)基質(zhì)（GM）中分離具有干性的GSCs與NSPCs細胞。細胞膜上是否具有EGF的受體蛋白可作為判斷細胞是否處于增殖期，因此利用EGF-APC抗體把GSCs分為E-GBM和E+GSC兩個(gè)子集、把NPSC分為E-NPC和E+NSPC兩個(gè)子集（圖1a），然后分別對四個(gè)子集進(jìn)行ATAC-seq測序分析。比較E-GBM與（E+GSC和E+NSPC）的ATAC-seq數據，獲得了與干性細胞發(fā)育相關(guān)的5020個(gè)差異峰（圖1b）。用基因注釋工具（GREAT）對差異峰進(jìn)行功能富集分析發(fā)現，GSC與NSPC共有基因的主要功能與維持細胞活性、細胞增殖相關(guān)（圖1c）。作者將分析重點(diǎn)放在GSC和NSPC之間的差異，發(fā)現了10509個(gè)差異峰（圖1d），并對差異峰進(jìn)行基因注釋和功能分析發(fā)現，GSC與NSPC差異基因的主要功能與細胞遷移、運動(dòng)、細胞外基質(zhì)（ECM）相關(guān)（圖1e）。這表明GSCs主要以細胞遷移為主要特征。

   作者對四組的ATAC-seq數據進(jìn)行motif分析，通過(guò)比較（E-GBM+NSPC）與E+GSC的ATAC-seq數據得出腫瘤特異性相關(guān)的轉錄因子列表（圖2a）。比較E-GBM與（E+GSC和E+NSPC）的ATAC-seq數據得出干性細胞發(fā)育相關(guān)的轉錄因子列表（圖2b）。對E+GSC/E-GBM細胞進(jìn)行RNA-seq測序，檢測多種轉錄因子表達情況，發(fā)現TEAD1在GSC中具有較高的表達水平，且在E+GSC中表達更高（圖2c）。

為了評價(jià)TEAD1與GBM亞型的相關(guān)性，作者從TCGA數據庫中獲得了GBM中TEAD家族的RNA-seq數據，發(fā)現了TEAD1表達最高（圖2d）。并且在作者分選細胞的RNA-seq數據中也得到了相同的結果（圖2e）。

作者利用CRISPR-Cas9基因組編輯技術(shù)在GBM中分別敲除TEAD1和TEAD4（圖3a）。比較在無(wú)血清培養基中對照組與兩個(gè)敲除組細胞的生長(cháng)曲線(xiàn)，發(fā)現敲除TEAD1會(huì )導致生長(cháng)抑制更加明顯（圖3b）。在低附著(zhù)條件下比較三組細胞形成細胞球的數量（圖3c）和球體的直徑（圖3d），TEAD1敲除株中細胞球的直徑最小。Transwell侵襲實(shí)驗（圖3e）與細胞球體分散測定（圖3f）中敲除TEAD1或TEAD4都會(huì )導致GBM遷移率減少的結果。最后，在TEAD1敲除組中恢復表達TEAD1，并觀(guān)察細胞球體遷移（圖3g），結果表明恢復表達TEAD1后能部分挽救敲除后的遷移缺陷。上述結果表明TEAD1/4與GBM的遷移能力相關(guān)。

作者使用TEAD1敲除細胞與GBM細胞在小鼠體內進(jìn)行原位移植，來(lái)觀(guān)察TEAD1在體內是否同樣具有影響GBM細胞侵襲能力。在原位移植腫瘤細胞后3.5個(gè)月進(jìn)行組織學(xué)分析，發(fā)現敲除TEAD1后導致體內細胞侵襲能力下降，處于增殖期的細胞數減少（圖4a），組織中TEAD1蛋白表達下降（圖4b），切片中腫瘤細胞的數量下降（圖4c）。通過(guò)評價(jià)每張切面中腫瘤擴散的面積總和與腫瘤的體積（圖4d）發(fā)現敲除組細胞擴散范圍主要位于注射部位，而GBM組細胞在體內的侵襲范圍較遠（圖4e）。以上結果表明，TEAD1在體內也會(huì )影響GBM的遷移能力。

根據RNA-seq與ATAC-seq數據分析基因表達與染色質(zhì)開(kāi)放性的相關(guān)性（圖5a），結果顯示中高水平基因表達與基因啟動(dòng)子中開(kāi)放染色質(zhì)存在的強相關(guān)性。對不同亞型的GBM細胞進(jìn)行ATAC-seq分析，尋找TEAD1的靶基因（圖5b），其中EGFR、AQP4和CDH4的染色質(zhì)開(kāi)放區域與TEAD1的motif有較強的相關(guān)性。用ChIP-PCR驗證TEAD1與EGRF、AQP4、CDH4的結合情況（圖5c），結果發(fā)現TEAD1與三個(gè)基因的結合能力較強。同時(shí)在敲除TEAD1會(huì )導致AQP4和CHD4蛋白表達水平下降（圖5d）。以上數據表明TEAD1作為AQP4和CDH4的轉錄因子，參與調控AQP4和CDH4的表達。

已知EGFR與GBM的增殖、遷移能力相關(guān)，同時(shí)TEAD1也是EGFR的轉錄因子，因此作者進(jìn)一步關(guān)注TEAD1與EGFR的關(guān)系。作者觀(guān)察到在體內敲除TEAD1導致EGFR的蛋白水平表達下降（圖6a），然后在體外GBM細胞中驗證TEAD1與EGFR的調控關(guān)系，發(fā)現敲除TEAD1會(huì )導致EGFR表達下降、恢復TEAD1后EGFR的表達也得到恢復（圖6b）。最后驗證了EGFR下游兩個(gè)通路的關(guān)鍵基因AKT和ERK的表達，發(fā)現敲除TEAD1會(huì )導致pERK下降（圖6c）。

為了進(jìn)一步尋找TEAD1參與調控細胞遷移的靶基因，通過(guò)比較ATAC-seq富集基因以及敲除TEAD1后GBM的RNA-seq數據，發(fā)現32個(gè)基因的染色質(zhì)開(kāi)放區域與TEAD1的motif有相關(guān)性。其中AQP4是三個(gè)下游靶基因中唯一一個(gè)直接受TEAD1調控的基因（圖7a）。在后續的細胞球分散實(shí)驗中，敲除了TEAD1而過(guò)表達AQP4能恢復因TEAD1缺失而引起下降的侵襲能力（圖7b）。最后RT-QPCR結果表明在敲除組細胞中恢復TEAD1的表達能恢復AQP4的表達。這些數據進(jìn)一步證明AQP4在GBM遷移中發(fā)揮作用，同時(shí)還證明了TEAD1和下游AQP4表達之間的直接機制聯(lián)系。