全基因組分析前列腺癌細胞中HOXC4和HOXC6調 控的基因和結合位點(diǎn)

圖1. HOX蛋白介導的前列腺癌轉錄組調控的競爭模型。

左圖：HOXB13在正常前列腺組織中表達，與其靶位點(diǎn)結合并調節前列腺轉錄組。正常前列腺細胞中HOXC6的水平非常低，因此該TF對基因調節沒(méi)有幫助。右圖：HOXC6在前列腺腫瘤中異常表達，高水平的HOXC6蛋白與HOXB13競爭共同結合位點(diǎn)的占據。結合的HOXC6可能會(huì )增加癌基因的表達（如果它募集了一種共激活因子）或降低腫瘤抑制因子的表達（如果它募集了共抑制因子）。

    為了研究HOXC家族成員與前列腺癌之間的關(guān)系，作者使用22Rv1細胞作為模型系統來(lái)研究HOXC4和HOXC6。以HOXC4或HOXC6m RNA為靶點(diǎn)，用siRNA進(jìn)行分別敲除和雙敲除，處理后差異表達的基因火山圖表明，盡管HOXC4和HOXC6都減少了大約相同的量，但受HOXC6敲低影響的基因數量大于受HOXC4敲減影響的基因數量（圖1A）。由于兩個(gè)TF 的DNA結合結構域非常相似，因此，作者還進(jìn)行了HOXC4和HOXC6的雙重敲除，并鑒定了在同時(shí)敲除兩個(gè)HOXC TF時(shí)被解除調節的更大基因集（圖1B），表明這些TF具有至少部分冗余的功能。通路分析顯示，HOXC4或HOXC6的siRNA敲低后被下調的基因與癌癥和細胞周期有關(guān)（圖1C）

圖2.HOXC6和HOXC4調控的基因的鑒定。

（A）在siRNA介導的HOXC6、HOXC4或兩者同時(shí)敲除后，基因上調或下調的火山圖。為便于顯示，這些基因的調整p值未顯示為刻度；

（B）韋恩圖，比較在敲除HOXC6、HOXC4或兩者同時(shí)進(jìn)行的基因下調（左圖）或上調（右圖）。

（C）敲除HOXC6/HOXC4后下調基因的通路分析。

   由于RNA-seq分析表明HOXC4和HOXC6可能具有冗余功能，因此作者接下來(lái)想確定它們在全基因組范圍內的結合情況。使用帶有Flag標簽的HOXC6和HOXC4蛋白進(jìn)行CHIP-seq分析，HOXC6的CHIP-SEQ分析表明，約73％的HOXC6峰包含典型的富AT的HOX結合基序，該基序位于峰的中心（圖2A 上）。然后，作者注釋了HOXC6結合位點(diǎn)相對于它們在特定基因組特征中的位置。發(fā)現HOXC6峰通常位于遠端基因間區域或內含子中（圖2A 中）。對HOXC6峰距最近的轉錄起始位點(diǎn)（TSS）的距離進(jìn)行了類(lèi)似的注解，發(fā)現HOXC6主要結合到距TSS上游或下游10 kb遠的調節元件上（圖2A 下）。HOXC4的ChIP-seq實(shí)驗，確定了位于峰中心的富含AT的基序并且觀(guān)察到與HOXC6相似的峰分布，該峰與TSS的距離和基因結構有關(guān)（圖2B）。

圖3.大多數HOXC4和HOXC6結合位點(diǎn)都遠離TSS。

（A）上圖：顯示的是在所有HOXC6結合位點(diǎn)集中確定的最高等級的從頭基序； 在以HOXC6峰為中心的-/ + 250bp窗口內顯示了基序的富集。 中圖：顯示的是HOXC6峰相對于基因結構的位置。 下圖：顯示的是HOXC6峰相對于距最近的TSS的距離的位置。

（B）與（A）圖相同，但是是針對HOXC4結合位點(diǎn)。

   HOXC4和HOXC6的遠側結合模式表明它們可能是增強子結合的TF。通常將增強子鑒定為以H3K27Ac標記的開(kāi)放染色質(zhì)區域。因此，為進(jìn)一步表明HOXC結合位點(diǎn)，作者使用測序（ATAC-seq）數據轉座酶處理染色質(zhì)的公開(kāi)檢測方法確定了HOXC4或HOXC6峰是否位于開(kāi)放染色質(zhì)區域。結果表明大多數HOXC6和HOXC4結合位點(diǎn)不在開(kāi)放染色質(zhì)中（圖3A）。由于大多數HOXC4和HOXC6結合位點(diǎn)不在ATAC-seq識別的區域內，這使得作者進(jìn)一步研究了峰的特征。HOXC6和HOXC4的結合強度在H3K27Ac +或H3K27Ac-峰和ATAC-seq +或ATAC-seq峰處大致相等（圖3B），這表明HOXC6和HOXC4結合在核小體占據的染色質(zhì)區域與無(wú)核小體、活性增強子的TFs結合一樣。

圖4.大多數HOXC6和HOXC4結合位點(diǎn)位于核小體占據的區域。

（A）顯示了以HOXC6或HOXC4峰的基因組位置為中心的ATAC-seq和H3K27Ac ChIP-seq數據的標簽密度圖和熱圖。

（B）顯示的是HOXC6和HOXC4峰的標簽密度圖，分為H3K27Ac標記或未標記的組以及ATAC-seq鑒定為或未鑒定為開(kāi)放染色質(zhì)的位點(diǎn)。

   有研究表明，果蠅中的不同HOX基因可以與相似的基因組位點(diǎn)結合。為了測試在前列腺癌中上調的人類(lèi)HOX基因是否也是如此，作者比較了HOXC6和HOXC4的結合位點(diǎn)。發(fā)現大多數HOXC4結合位點(diǎn)與HOXC6結合位點(diǎn)重疊（圖4A）。因為HOXB13 DNA結合結構域與HOXC6 DNA結合結構域相似為73.7％，所以作者用HOXB13抗體，在22Rv1細胞中進(jìn)行HOXB13 ChIP-seq。發(fā)現37％的HOXB13結合位點(diǎn)也被HOXC4和HOXC6結合。HOXC4或HOXC6共共有2321個(gè)HOXB13峰（圖4A）。HOXC4，HOXC6和HOXB13共同結合的峰的特征表明，大多數共同結合的位點(diǎn)位于遠距離基因間隔區或內含子區域內，距離TSS超過(guò)10kb（圖4B）。

圖5. HOXC6，HOXC4和HOXB13與一組常見(jiàn)的調控元件結合。

（A）顯示的是比較HOXC6，HOXC4和HOXB13結合位點(diǎn)的三向維恩圖。

（B）上：顯示的是HOXC6，HOXC4和HOXB13共結合位點(diǎn)相對于基因結構的位置。下：顯示的是HOXC6，HOXC4和HOXB13共結合位點(diǎn)相對于距最近的TSS的距離的位置。

   因為已有報道HOXB13，FOXA1和AR可以共定位于常見(jiàn)的結合位點(diǎn)，所以作者將HOXC4和HOXC6結合位點(diǎn)與FOXA1和AR結合位點(diǎn)進(jìn)行比較。進(jìn)行了ChIP-seq識別22Rv1細胞中的FOXA1位點(diǎn)。并使用了兩種不同的FOXA1抗體和IDR確認兩種抗體都檢測到相似的結合位點(diǎn)。作者發(fā)現，HOXC4或HOXC6結合位點(diǎn)的強度與關(guān)鍵前列腺癌轉錄因子HOXB13，FOXA1和AR的結合位點(diǎn)之間存在顯著(zhù)的相關(guān)性（圖5A）。然而，只有一個(gè)結合位點(diǎn)的子集被所有5個(gè)TFs綁定。有趣的是，這個(gè)位點(diǎn)的子集是位于以H3K27A為標記的開(kāi)放染色質(zhì)中的位點(diǎn)（圖5B）。

圖5. HOXC6，HOXC4，HOXB13，FOXA1和AR與活性增強子共結合。

（A） 顯示的是HOXC4，HOXC6，HOXB13，FOXA1，和AR熱圖以HOXC4，HOXC6，HOXB13，FOXA1或AR結合位點(diǎn)的基因組位置為中心。每行代表該行旁邊顯示的TF結合位點(diǎn)的基因組位置。在每一列中，紅色框概述了給定因子的結合位點(diǎn)，該位點(diǎn)映射在同一因子的結合位置。

（B）顯示的是HOXC6，HOXC4，HOXB13，FOXA1，AR，ATAC-seq，H3K27Ac和H3K4me1數據（以列標題表示）的標簽密度圖和熱圖，這些數據以與HOXC6，HOXC4和HOXB13共同結合的位點(diǎn)的基因組位置為中心。