ChIP-seq、ATAC-seq、RNA-seq聯(lián)合解析PTEN-BRG1協(xié)同致死機制

    鑒于最近在癌癥中靶向染色質(zhì)調節因子方面的成功，作者基于CRISPR-cas9技術(shù)在PTEN敲除的22RV-1細胞及PTEN未敲除的22RV-1細胞進(jìn)行了高通量測序篩選，以鑒定PTEN缺失的PCa細胞中特別需要的表觀(guān)遺傳調節因子。該篩選的表觀(guān)遺傳調節因子文庫中包含517個(gè)基因，分別編碼表觀(guān)遺傳的書(shū)寫(xiě)、擦除和識別。高通量測序初篩分別鑒定出PTEN-complete和PTEN-KD細胞中分別有47個(gè)和65個(gè)基因跟細胞生長(cháng)相關(guān)，其中兩種細胞類(lèi)型中有33個(gè)基因重疊(圖1C)，表明無(wú)論PTEN水平如何，這些基因可能對PCa細胞的生長(cháng)都很重要。接下來(lái)，為了識別對PTEN缺陷腫瘤重要的表觀(guān)遺傳調控因子，作者將重點(diǎn)放在另外32個(gè)基因上，并使用單個(gè)siRNAs進(jìn)行驗證篩選，以比較PTEN敲除與否對22RV-1細胞的影響。MTT分析結果顯示，BRG1是差異是最明顯的(圖1D)。BRG1敲除明顯導致了PTEN-WT與PTEN-KD細胞的預期差異(圖1D)。在對照中，SF3B1和DDX18等基因沒(méi)有表現出這種選擇性。有趣的是，多種SWI/SNF組分(如SMARCE1、SMARCA5等）在PTEN-KD細胞中均有預期差異，這表明SWI/SNF復合物可能對這些細胞具有生長(cháng)優(yōu)勢。BRG1是SWI/SNF染色質(zhì)重構復合物的酶亞基，可以被小分子抑制劑調節，因此作者選擇BRG1進(jìn)行進(jìn)一步的分析。

為了評價(jià)BRG1在前列腺癌中的臨床意義，作者使用預先驗證的BRG1抗體開(kāi)展了免疫組組化，免疫組化的樣本自于由122個(gè)的亞洲根治性前列腺切除術(shù)組織芯片(TMA)。前列腺標本檢查結果顯示腫瘤組織中BRG1表達 (均數為4.8;n = 122)較正常組織高(均值為3.2;n BRG1免疫染色強度與腫瘤中Gleason評分和PSA水平呈正相關(guān)。BRG1水平升高的患者生化復發(fā)的風(fēng)險更高(P = 0.0004;圖1 f)。作者進(jìn)一步根據PTEN水平對患者進(jìn)行分層。Kaplan-Meier生存評估分析顯示，BRG1蛋白水平與低PTEN表達的腫瘤預后不良呈正相關(guān)(P = 0.010;圖1 g)。而在PTEN高表達的腫瘤中，BRG1的預后意義未達到統計學(xué)意義(P = 0.289;圖1 g)。這些結果提示，在PTEN缺乏的情況下，BRG1的表達與前列腺腫瘤發(fā)生發(fā)展息息相關(guān)。

為了確定BRG1是否在pten缺乏的PCa細胞中是特別需要的，作者首先在一組PCa細胞系中研究了BRG1的功能。作者發(fā)現BRG1表達的減少顯著(zhù)降低了PTEN-null PCa細胞的生長(cháng)，包括PC3、LNCaP和C4-2細胞(圖2A)。BRG1 KD未改變PTEN-WT PCa細胞(22RV-1、BPH-1、LAPC4細胞)的生長(cháng)(圖2A)。在不依賴(lài)貼壁的生長(cháng)試驗中也證實(shí)了對BRG1的類(lèi)似依賴(lài)性。除22RV-1細胞外，PC3和LNCaP細胞中BRG1的缺失嚴重抑制了菌落的形成。重要的是，作者發(fā)現PTEN缺失細胞(PC3和LNCaP細胞)中PTEN的恢復使它們對BRG1下調不敏感。接下來(lái)作者研究了BRG1的原致瘤功能是否依賴(lài)于其染色質(zhì)重構活性。重新表達野生型的BRG1，能恢復BRG1缺失細胞的克隆形成和細胞遷移缺陷，而缺失atpase的BRG1則無(wú)此生物學(xué)功能(圖2B)。

考慮到PCa細胞的遺傳和表觀(guān)遺傳異質(zhì)性，作者在同一細胞中單獨或與同時(shí)敲除PTEN和BRG1。與預測一致，PTEN KD促進(jìn)細胞增殖，僅BRG1敲除對22RV-1和LAPC4細胞的生長(cháng)無(wú)明顯影響(圖2C)。與之形成鮮明對比的是，PTEN KD對BRG1耗竭有明顯的增敏作用。作者發(fā)現PTEN/BRG1雙KD將細胞生長(cháng)抑制到基礎水平(圖2C)。這一結果被皮下成瘤試驗結果進(jìn)一步證明。作者發(fā)現PTEN-KD 22RV-1細胞更容易受到BRG1敲除的影響，這說(shuō)明了PTEN和BRG1存在合成致死關(guān)系(圖2D)。從腫瘤體積可以看出，PTEN-KD細胞中BRG1的耗竭明顯減輕了腫瘤的發(fā)展進(jìn)程。IHC分析表明，在PTEN-KD腫瘤中沉默BRG1導致細胞增殖顯著(zhù)減少和凋亡增加。為了進(jìn)一步證明BRG1在PTEN-null PCa中是重要的，作者還進(jìn)行了心臟內注射實(shí)驗，以確定BRG1下調是否抑制了PTEN-null PC3細胞的轉移潛能。生物發(fā)光成像(BLI)顯示，注射BRG1-KD細胞的小鼠腫瘤細胞的骨定植明顯減少(圖2E)。與對照組相比，BRG1-KD組骨溶解明顯減少(圖2F)。隨著(zhù)骨轉移的減少(E-cadherin+細胞)，抗酒石酸磷酸酶(TRAP)陽(yáng)性染色在BRG1缺失后也隨之減少(圖2G)。綜上所述，這些結果提示BRG1是pten缺失的PCa細胞發(fā)生腫瘤所必需的。

為了進(jìn)一步確證BRG1-PTEN在體內的關(guān)系，作者利用GEMs來(lái)探討B(tài)RG1與PTEN之間的遺傳互作。因此，作者將Brg1fl/fl小鼠與Probasin-Cre (PBCre/+)小鼠雜交，以去除前列腺上皮細胞中的Brg1 (Brg1PC-/-小鼠)。對6個(gè)月大的Brg1PC-/-小鼠進(jìn)行的前列腺組織學(xué)檢查表明，僅Brg1失活不會(huì )導致前列腺葉的病理異常。接下來(lái)，作者將Brg1PC - / -小鼠與PtenPC -/-小鼠雜交(簡(jiǎn)稱(chēng)PtenPC-/-;Brg1PC-/-小鼠;圖3A和圖3B)。為了更好地觀(guān)察腫瘤的進(jìn)展，化合物小鼠也與Rosa26-LSL熒光素酶報告小鼠交叉。與PtenPC -/-小鼠相比，五個(gè)月（PtenPC -/-;Brg1PC -/-）小鼠的前列腺生物發(fā)光強度降低了2- 3倍(圖3B)，表明在Pten-null小鼠模型中，BRG1的缺失抑制了腫瘤的進(jìn)展。組織病理學(xué)檢查證實(shí)Brg1的缺乏可抑制Pten-null前列腺腫瘤的進(jìn)展。HGPIN區域的特征是細胞核異型性聚集細胞的粒內增殖，與（PtenPC-/-;Brg1PC-/-）小鼠相比，在PtenPC-/-小鼠的前列腺中HGPIN區域增大(圖3中,C和D)。此外,12只PtenPC-/-小鼠中有3只小鼠發(fā)展成浸潤型腺癌，如圖3e所示，一些腫瘤細胞突破基質(zhì)細胞 (SMAα染色)和入侵的前列腺基質(zhì)(雄激素受體(AR)染色,箭頭) 。與此相反，Pten和Brg1失活的小鼠在增生期或低分級PIN (LGPIN)期出現病變，且病變大部分被抑制，外顯性不完全(圖3,C和D)。同樣，（PtenPC-/-;Brg1PC-/-）小鼠未見(jiàn)侵襲性腺癌的發(fā)生 (圖3E)。通過(guò)Ki67染色，作者發(fā)現（PtenPC-/-;Brg1PC-/-）小鼠前列腺增生指數明顯降低?？傊?，作者的研究結果表明BRG1對PTEN缺乏引起的前列腺腫瘤的進(jìn)展起關(guān)鍵作用。

為了確定BRG1在PTEN缺陷的腫瘤細胞中的作用，作者運用了類(lèi)器官培養平臺，類(lèi)器官培養能大體上模擬前列腺的組織學(xué)特征，包括在基底細胞中具有核AR表達和p63表達的多層結構。作者從（TMPRSS2-CreERT2-IRES-GFP;Ptenfl/fl）小鼠前列腺中分離出管腔細胞，如前所述。PTEN的缺失通過(guò)4-羥基他莫西芬(4-OHT)完成，BRG1通過(guò)慢病毒轉導被敲除(圖3F)。正如預測的那樣，PTEN的缺失促進(jìn)了類(lèi)前列腺器官的形成，而B(niǎo)RG1的缺失并不影響PTEN-WT小鼠的類(lèi)前列腺器官的起始能力或大小(圖3F)。相比之下,作者發(fā)現BRG1缺失深深地影響了PTEN-deficient小鼠的前列腺類(lèi)器官形成能力，諸如前列腺類(lèi)器官的大小和Ki67 +細胞的數量(圖3中,F和G)。為了更進(jìn)一步確定BRG1是否是PTEN-deficient腫瘤特異需要的, 作者評估了BRG1 KD在前列腺c-Myc過(guò)表達小鼠的類(lèi)器官培養中的作用。Myc擴增或過(guò)表達常見(jiàn)于人類(lèi)腫瘤中，因此，該模型可能代表了與不同于PTEN缺失引起的的人類(lèi)PCa。事實(shí)上，作者發(fā)現Brg1耗竭并不改變c-Myc過(guò)表達引起的致瘤潛能(圖3H)。接下來(lái)，作者研究了其他常見(jiàn)的PCa基因改變，如p53缺失或SPOP多態(tài)，是否會(huì )影響PTEN與BRG1的合成致死關(guān)系。為此，作者使用Pten和Tp53雙敲除小鼠(PtenPC -/-;Tp53PC -/-)，發(fā)現BRG1- KD仍能抑制類(lèi)前列腺器官的生長(cháng)。同樣，患者來(lái)源的SPOP突變體(F133V)在PC3和22RV-1 PTEN-KD細胞中過(guò)表達也沒(méi)有改變BRG1下調的敏感性。因此，GEMs和類(lèi)器官培養實(shí)驗共同證明了Brg1在pten突變的PCa中的關(guān)鍵和特殊功能。

下一步，作者的目標是探索PTEN缺失使細胞對BRG1耗竭敏感的分子基礎。作者注意到，PTEN-null PCa細胞(PC3、LNCaP和C4-2細胞)中的BRG1蛋白水平高于正常前列腺上皮細胞(RWPE-1細胞和小鼠前列腺[mAP])或PTEN-WT PCa細胞(BPH-1、22RV-1和LAPC4細胞)(圖4A)。在PtenPC-/-小鼠前列腺中也觀(guān)察到類(lèi)似的結果。與WT對照組相比，PTEN缺失組前列腺中BRG1蛋白水平(而非mRNA)明顯升高(圖4B)。重要的是，在PC3細胞中PTEN的重新引入導致了BRG1蛋白的顯著(zhù)降低，同時(shí)增加了BRG1多泛素化，而不影響B(tài)RG1 mRNA水平(圖4,C和D)。這些觀(guān)察結果表明，PTEN通過(guò)轉錄后調控來(lái)調控BRG1的表達。

在PTEN缺失的情況下，最顯著(zhù)的信號事件是AKT的組成性激活，它影響蛋白酶體依賴(lài)蛋白的降解(33,38)。事實(shí)上,作者研究結果表明通過(guò)siRNA-KD或LY294002處理抑制AKT信號通路，降低了BRG1蛋白的穩定性但不改變其mRNA水平(圖4中,E和F)。利用 MG132和LY294002共處理細胞，能阻礙BRG1蛋白的降解(圖4),這就強調了PTEN缺失激活AKT軸增強BRG1蛋白的穩定性是依賴(lài)于蛋白酶體的。AKT磷酸化糖原合成酶kinase-3β(GSK3β)第9位的絲氨酸并抑制其激酶活性(39-41)。因此作者推斷,PTEN缺失增強BRG1的穩定性通過(guò)降低GSK3β活性來(lái)實(shí)現的。為了驗證這種推斷,作者首先證明了在細胞內BRG1能與GSK3β互作(圖4 g)。GST pull-down的結果分析表明,BRG1羧基端 (aa1300-1647)對BRG1與GSK3β之間的直接聯(lián)系負責。從功能上來(lái)說(shuō), 在HEK293細胞中過(guò)表達表達野生型或者持續激活的GSK3β(GSK3β-S9A)能縮短BRG1蛋白的半衰期。更重要的是,在A(yíng)KT敲除的PC3細胞中，消耗GSK3β能延長(cháng)BRG1蛋白的半衰期,表明PTEN-AKT穩定BRG1蛋白是通過(guò)GSK3β來(lái)實(shí)現的 (圖4h)?；颊邩吮痉治鲎C實(shí)了PTEN對BRG1的調節作用。122個(gè)PCa樣本中BRG1與PTEN蛋白呈負相關(guān)(r = -0.427, P < 0.0001;圖4)?？傊?作者的結果表明, 在PCa細胞中，PTEN/AKT/GSK3β信號軸調控著(zhù)BRG1的穩定性。因此，在PTEN缺乏的腫瘤中BRG1上調，這可能導致細胞依賴(lài)于BRG1的存在。

作者試圖明確PTEN/AKT/GSK3β調節BRG1穩定性的調控機制。先前的研究已經(jīng)報道,GSK3β直接磷酸化底物,便于識別后續的蛋白降解的E3連接酶。有趣的是,共識序列比對發(fā)現在BRG1的羧基端的S1417和S1421位置有一個(gè)進(jìn)化保守的GSK3β磷酸化序列(XpS/TGXXpS/T) (圖5)。質(zhì)譜實(shí)驗驗證結果表明在HEK293細胞BRG1的S1417和S1421位點(diǎn)均被磷酸化,且這些磷酸化信號在GSK3β表達后會(huì )進(jìn)一步加強。為了確定GSK3β是否直接磷酸化BRG1,作者進(jìn)行體外激酶實(shí)驗。結果表明,只有野生型的BRG1能被GSK3β有效磷酸化,而突變的BRG1-S1417A/S1421A (BRG1-SA)則不能被磷酸化(圖5 b),這就說(shuō)GSK3β是直接對BRG1的S1417/1421位點(diǎn)進(jìn)行磷酸化。作者進(jìn)一步生產(chǎn)了一種抗體，這種抗體可以識別BRG1在S1417/1421位點(diǎn)的磷酸化。重新恢復PC3細胞中PTEN的表達能明顯增強內源的phospho-BRG1-S1417/1421水平,而GSK3β激酶抑制劑CHIR-99021處理能極大地削弱了這個(gè)磷酸化(圖5)。值得注意的是,λ-phosphatase處理實(shí)驗證實(shí)GSK3β磷酸化BRG1-S1417/1421是特異的(圖5)。

FBXW7和β-TrCP是已知的Skp1-Cullin1-F-box蛋白類(lèi)的E3泛素連接酶，它們與PTEN/GSK3β-mediated蛋白質(zhì)降解有關(guān)。作者發(fā)現使用siRNA-KD沉默FBXW7極大地增強了BRG1在PCa細胞中蛋白質(zhì)含量，但沉默β-TrCP則無(wú)此效果。同樣FBXW7過(guò)表達刺激了PC3細胞中BRG1的多泛素化(圖5D)。與此相應地，干擾FBXW7可恢復AKT缺失細胞中的BRG1蛋白水平(圖5E)，從而確定了PTEN-AKT和FBXW7調節BRG1穩定性的因果關(guān)系。接下來(lái),作者進(jìn)行了一次體外泛素化分析實(shí)驗來(lái)確定是否確實(shí)FBXW7靶向BRG1,使其磷酸化進(jìn)而降解?？狗核乜贵wIB顯示，當丙氨酸取代絲氨酸(BRG1-S1417A/S1421A, BRG1-SA)時(shí)，多泛素化的BRG1明顯減少，而模擬磷酸化的BRG1-S1417D /S1421D (BRG1-SD)蛋白比WT蛋白表現出更明顯的多泛素化(圖5F)。同理，外源表達的BRG1-SD蛋白與WT BRG1蛋白相比具有更高的泛素化轉化率，而B(niǎo)RG1-SA在HEK293細胞中更為穩定。作者進(jìn)一步證明了P-S1417/1421-BRG1促進(jìn)了HEK293細胞中FBXW7與BRG1的直接結合。同時(shí)BRG1-SA與FBXW7表現出分離狀態(tài)，而模擬磷酸化的BRG1-SD蛋白與FBXW7的結合則更強(圖5G)。

為了證實(shí)上述觀(guān)察的現象，作者利用CRISPR-Cas9技術(shù)將內源性BRG1中的S1417/1421替換為PC3細胞中的Ala或Asp，從而分別生成SA和SD細胞(見(jiàn)圖5E)。事實(shí)上，BRG1-SD蛋白表現出更明顯的降解和多泛素化，而B(niǎo)RG1-SA比其WT對應物則更穩定(圖5H)。MG132處理減弱了BRG1-SD蛋白的加速降解效果。隨著(zhù)SA細胞中BRG1磷酸化水平的降低，BRG1與FBXW7的結合減少，而在SD突變體中，BRG1與FBXW7的結合則增加(圖5I)?？傊?這些結果表明, GSK3β介導的BRG1-S1417/1421磷酸化促進(jìn)了SCF-FBXW7 E3連接酶對其識別,進(jìn)而導致BRG1降解。在異種移植模型中作者進(jìn)一步評估了BRG1-S1417/1421磷酸化的意義(圖5J)。作者發(fā)現SA細胞更具有致瘤性，而SD細胞來(lái)源的異種移植物明顯小于WT PC3細胞來(lái)源的異種移植物。進(jìn)一步對PCa標本進(jìn)行分析發(fā)現，30個(gè)PCa標本中PTEN與p-S1417/1421水平密切相關(guān)(r = 0.688, P = 5.5×10-5;圖5 K)。此外，BRG1與p-S1417/1421水平呈負相關(guān)(r=-0.600, P=0.0007;圖5K)。這些結果都證明PTEN/AKT/GSK3β軸通過(guò)FBXW7依賴(lài)的泛素蛋白酶體途徑來(lái)調節BRG1的降解。

為了研究PTEN缺陷腫瘤依賴(lài)于BRG1上調的原因，作者對伴有或不伴有PTEN敲除的BRG1缺失的22RV-1細胞進(jìn)行了轉錄組分析。通過(guò)對差異表達基因(DEGs)的聚類(lèi)分析，作者發(fā)現PTEN/BRG1雙敲除細胞中5489個(gè)基因的表達發(fā)生了顯著(zhù)變化，而這些基因在Control、BRG1- KD和PTEN-KD細胞中表達模式明顯不同。與這些結果一致的是，KEGG-DEG關(guān)系網(wǎng)絡(luò )表明，PTEN缺失細胞中的BRG1缺失顯著(zhù)改變了PCa進(jìn)程、細胞周期及細胞運動(dòng)相關(guān)的過(guò)程。通過(guò)RT-qPCR實(shí)驗進(jìn)一步驗證所選基因的差異表達，并將結果匯總成heatmap圖(圖6A)。為了鑒定BRG1介導的下游靶點(diǎn)和通路，作者對對照細胞和PTEN-KD的22RV-1細胞進(jìn)行ChIP-Seq分析。PTEN缺失導致BRG1在BRG1峰值的全局占用率增加(圖6B)。PTEN-KD細胞中共有6279個(gè)基因(67.9%的BRG1結合基因)表現出比對照細胞更強的BRG1結合?？紤]到BRG1是激活核小體的ATP酶的核心亞基，作者推斷PTEN缺陷細胞中的BRG1敲除可能損害了染色質(zhì)構型。為了驗證這種可能性，作者進(jìn)行了染色質(zhì)可及性測序(ATAC-Seq)，以比較PTEN-KD和PTEN/BRG1-KD細胞之間的開(kāi)放染色質(zhì)區域(OCS)。全基因組ATAC-Seq強度圖顯示，與完整的BRG1細胞相比，BRG1敲除的PTEN-KD細胞中導致了60%以上的OCR減少。與PTEN-KD細胞相比，PTEN/BRG1-KD細胞中有60740個(gè)DNA可及性降低的峰(圖6C)。(圖6D)展示的是少數代表性的染色質(zhì)可及性測序峰圖，其結果表明BRG1缺失導致ETV-1和cav2基因位點(diǎn)的DNA可達性降低?？傊?，作者的結果表明BRG1的敲除導致了PTEN缺失腫瘤中染色質(zhì)動(dòng)力學(xué)的顯著(zhù)變化。

為了鑒定PTEN缺失的PCa中BRG1的可能靶點(diǎn)，作者將BRG1的峰值與OCR和DEGs的變化進(jìn)行比對;其中有553個(gè)基因重疊，這些重疊基因被稱(chēng)為PTEN依賴(lài)性的BRG1信號 (圖6E)。KEGG-Pathway分析發(fā)現，這些基因與調控干細胞多能性的信號、軸突引導、腫瘤轉錄失調、MAPK信號通路相關(guān)。接下來(lái)，作者發(fā)現將PTEN依賴(lài)性的BRG1信號通過(guò)K 均值聚類(lèi)分析將患者分成兩組，兩組在生化復發(fā)風(fēng)險上有顯著(zhù)差異(圖6F)。此外，通過(guò)比較PTEN-WT和PTEN-null腫瘤中不同表達量的基因集，作者發(fā)現PTEN-null腫瘤具有較高的BRG1信號活性。

雖然很難將BRG1功能歸為一個(gè)離散的靶基因，但作者測量了幾個(gè)已知對前列腺腫瘤發(fā)生有重要意義的基因的表達。選取PCa、MAPK信號中關(guān)鍵調節因子的代表基因，以及表觀(guān)遺傳調節因子，包括c-Myc、ETV-1、NCoA2、ERRB2、FGFR3、K-Ras、Sin3A、BMI1和DOT1L(圖7A)。ChIP-qPCR實(shí)驗證實(shí)BRG1存在于這些基因位點(diǎn)，這與該亞基在SWI/SNF靶向定位中的直接作用一致(圖7B)。ChIP-qPCR結果顯示，BRG1缺失顯著(zhù)降低了c-Myc、ETV-1、K-Ras和BMI1基因位點(diǎn)的H3K9ac水平(圖7B)。由于H3K27ac能區分活躍的和不活躍的染色質(zhì)(45)，作者一致檢測到在同一位點(diǎn)H3K27me3同時(shí)增加(圖7B)。這些結果表明BRG1的缺失有利于抑制染色質(zhì)狀態(tài)，從而抑制基因表達。聚焦于c-Myc和MAPK信號,作者確認, 與PTEN-deleted細胞相比，PTEN/BRG1-KD細胞中c-Myc表達和p-ERK激活下調到本底水平在 (圖7中,C和D)。接下來(lái),作者將作者的分析擴展到基因工程小鼠，其結果顯示, 與PtenPC -/-小鼠相比，（PtenPC -/-;Brg1PC -/-）小鼠中c-Myc和p-ERK水平明顯減少 (圖7E)。此外，在前列腺癌患者中，BRG1轉錄組與c-Myc和MAPK信號相關(guān)基因密切相關(guān)?？傊?，這些數據表明，BRG1重構了PTEN缺失的PCa細胞的染色質(zhì)結構，并啟動(dòng)了涉及c-Myc和MAPK信號的原癌基因轉錄組，導致細胞變得依賴(lài)于BRG1。

最后，作者使用PtenPC-/-小鼠進(jìn)行了臨床前研究，這些小鼠在2.5個(gè)月大時(shí)隨機接受溶劑處理或PFI-3處理，這是一個(gè)可以識別PIN的時(shí)間點(diǎn)。MRI結果顯示，PFI-3處理顯著(zhù)降低了腫瘤體積(平均腫瘤體積減少約43%)，所有小鼠的病理反應接近完全(n = 5;圖8 e)。與溶劑組的腫瘤特征相反，PFI-3處理小鼠的腫瘤特征為增生或LGPIN(圖8F)。一致地， PFI-3抑制劑處理的PtenPC-/-腫瘤顯示ki-67陽(yáng)性有絲分裂細胞的頻率急劇下降，同時(shí)誘導細胞凋亡。值得注意的是，PFI-3在小鼠中耐受良好，因為它沒(méi)有造成顯著(zhù)的體重下降、嗜睡或喂養異常。因此，PFI-3藥物抑制SWI/SNF重構復合物在治療PCa小鼠模型中得到了有益的結果。