生信分析文章：比對染色質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò )解析SOX2對神經(jīng)干細胞干性維持的作用

Mapping the Global Chromatin Connectivity Network for SOX2 Function in Neural Stem Cell Maintenance

作者為了確定神經(jīng)干細胞中SOX2對轉錄的調控作用，  分析了不同品牌的RNA聚合酶Ⅱ（pol II）抗體在野生型小鼠NSC（wTR1、wTR2 、wTR3）和SOX2敲除小鼠NSC（mTR1、mTR2、mTR3）中所產(chǎn)生的ChIA-PET數據結果，鑒定了RNA pol II在啟動(dòng)子結合位點(diǎn)和遠程互作位點(diǎn)（圖1b）。統計分析發(fā)現，在SOX2敲除組（mut）中，無(wú)論是啟動(dòng)子結合位點(diǎn)還是遠程互作位點(diǎn)都比野生組（wt）少（圖1b）。同時(shí)，ChIA-PET結果顯示在敲除SOX2后，多個(gè)基因的啟動(dòng)子的遠程互作減少（圖1C-G）。這些數據表明，SOX2主要通過(guò)調控基因啟動(dòng)子的遠程互作來(lái)調控基因表達。

為了進(jìn)一步確定SOX2對轉錄的調控作用，根據SOX2-ChIP-seq結果把結合位點(diǎn)分為T(mén)SS結合點(diǎn)與遠程結合點(diǎn)，并分別于H3K27ac+和H3K4me1+的ChIP-seq結果進(jìn)行比較（圖2a，2b）。H3K27ac+是轉錄激活的標志蛋白，主要標示啟動(dòng)子與增強子的位置。H3K4me1+也是轉錄激活標志蛋白，主要標示增強子位置。結果發(fā)現SOX2的結合位點(diǎn)主要在遠程增強子的位置。（圖2b）。然后作者把遠程互作模式分為三類(lèi)：?jiǎn)?dòng)子與遠程啟動(dòng)子區域互作模式（P-P）、啟動(dòng)子與遠程區域互作模式（P-e）、非啟動(dòng)子間互作模式，比較發(fā)現pol II介導的遠程結合模式主要以p-p或p-e為主，約占90%（圖2c）。然后聯(lián)合SOX2-ChIP-seq結果發(fā)現SOX2的結合位點(diǎn)主要在p-e模式中（圖2d）。最后， SOX2的ChIP-seq數據，以及H3K27ac、H3K4me1的ChIP-seq，3種不同品牌的RNA聚合酶Ⅱ（pol II）抗體的ChIA-PET結果聯(lián)合分析，顯示SOX2的結合位點(diǎn)主要在遠程增強子區域。

在野生型小鼠NSC和SOX2敲除小鼠中，聯(lián)合pol II的ChIA-PET結果與SOX-2-ChIP-seq結果分析SOX2對下游靶基因的調控模式，結果顯示，SOX2在靶基因的遠程區域有許多結合位點(diǎn)，SOX2的敲除對靶基因的遠程互作有明顯的抑制作用。因此SOX2主要通過(guò)調控基因遠程結合區域來(lái)調控基因表達。

作者為了確定這些遠程結合位點(diǎn)是否具有增強子的作用，將SOX2遠程結合位點(diǎn)（即遠程增強子（DA））構建到熒光載體的啟動(dòng)子前，并把這些熒光載體導入斑馬魚(yú)神經(jīng)干細胞中，驗證SOX2的結合位點(diǎn)是否是增強子（圖4）。結果SOX2遠程結合區域均能檢測到綠色熒光信號，這說(shuō)明這樣遠程的結合位點(diǎn)具有增強子的作用。

對NSC細胞內整體的RNA轉錄水平進(jìn)行RNA-seq分析發(fā)現，敲除SOX2后，細胞整體RNA轉錄水平和具有遠程協(xié)作調控的相關(guān)RNA轉錄水平下降（圖5a）。當基因啟動(dòng)子與越多的增強子有互作時(shí)，基因的表達量越高（圖5b）。接下來(lái)作者比較wt（野生型小鼠）與mut（SOX2敲除型小鼠）神經(jīng)干細胞之間的基因表達差異，發(fā)現大多數基因在wt組中的表達比mut中的高（圖5c）。SOX2敲除，總體基因表達水平下降。然后對這些基因根據結合模式進(jìn)行分組比較表達差異（圖5d），結果顯示差異表達基因主要是以P-E模式（啟動(dòng)子與遠程增強子互作模式）互作。綜上所述，在NSC中，SOX2通過(guò)遠程互作模式對轉錄水平進(jìn)行調控。

SOCS3基因一種JAK/STAT信號傳導抑制因子，它能抵抗NSC早熟分化為星形膠質(zhì)細胞，同時(shí)也是SOX2的一個(gè)靶基因。RNA pol II的ChIA-PET結果與SOX2-ChIP-seq結果聯(lián)合分析顯示，SOX2在SOCS3基因的啟動(dòng)子及遠程互作區域有集合位點(diǎn)，SOX2通過(guò)遠程互作調控SOCS3基因的表達（圖6a）。作者在SOX2敲除的神經(jīng)干細胞中過(guò)表達SOCS3，細胞的生長(cháng)能力得到恢復（圖6b、6c）。

    綜上所述，SOX2主要通過(guò)介導染色質(zhì)遠程增強子與靶基因啟動(dòng)子相互作用，對靶基因轉錄水平進(jìn)行調控。