Transcription Restart Establishes Chromatin Accessibility after DNA

 Replication

    DNA復制過(guò)程中，與轉錄相關(guān)的 DNA結合蛋白會(huì )從DNA上游離，DNA進(jìn)行復制，復制完成后，轉錄因子又會(huì )重新結合到DNA上，回復轉錄水平，這個(gè)過(guò)程需要多長(cháng)時(shí)間，轉錄因子的結合順序是怎樣的，這是作者要討論的主題（圖1A）。作者為了區分復制與非復制細胞，利用5-乙炔基-20-脫氧尿苷（EdU）對DNA進(jìn)行標記EdU為帶有標記的dUTP，可以標記新生成的DNA鏈）（圖1B）。通過(guò)EdU不同處理時(shí)間將細胞分為復制新生代細胞（EdU處理10分鐘）和復制后成熟細胞（EdU處理2小時(shí)）。并且通過(guò)流式將帶標記的細胞分選出來(lái)（圖1C）。然后對新生代細胞、成熟期細胞、穩態(tài)細胞的三個(gè)重復樣本進(jìn)行ATAC-seq分析，用聚類(lèi)分析（圖1D）和主成分分析（圖1E），ATAC-peak（圖1F）分析比較組內和組間差異。結果顯示成熟期與穩定期比較相似，具有更多的開(kāi)放區域。而子代細胞的染色質(zhì)開(kāi)放區域較少。

    根據repli-ATAC-seq數據，比較子代細胞和成熟細胞分別在轉錄起始位點(diǎn)（TSS）（圖2A、B）、增強子位置（圖2C、D）附近的染色質(zhì)開(kāi)放區域。結果顯示在成熟期細胞中，TSS區域和增強子位置有更強的repli-ATAC-seq富集信號，這表明在TSS區域和增強子位置中，成熟期比子代有更多的染色質(zhì)開(kāi)放區域。對兩組細胞進(jìn)行RNA聚合酶5號絲氨酸磷酸化（RNA polii S5phos）的CHIP-seq數據進(jìn)行分析（圖2E、F）,比較兩組的轉錄活性。結果顯示成熟期細胞具有更高的轉錄活性。綜合上述結果顯示，轉錄因子與RNA聚合酶難以與新生的染色質(zhì)結合，從而導致轉錄沉默。

作者為了觀(guān)察染色質(zhì)開(kāi)放區域在子代細胞不同生長(cháng)時(shí)間的變化（圖3A），比較子代細胞不同生長(cháng)時(shí)間后（0分鐘、30分鐘、1小時(shí)、2小時(shí)）的repli-ATAC-seq數據，表明在30分鐘后染色質(zhì)開(kāi)放區域開(kāi)始開(kāi)放（圖3B）。而RNA polii S5phos的ChIP-seq數據表明轉錄程序在復制后30分鐘內得到恢復，并在2小時(shí)后達到DNA復制前水平（圖3C）。隨著(zhù)DNA復制后時(shí)間增加，全基因組（圖3D）和特定區域（圖3E）的TSS區域上富集信號逐漸增強。比較不同時(shí)間內repli-ATAC-seq富集峰能達到正常水平時(shí)的數量（圖3F），結果表明在僅8%的染色質(zhì)開(kāi)放區域來(lái)自于R0(新生代細胞)，隨著(zhù)時(shí)間增加，越來(lái)越多的染色質(zhì)開(kāi)放區域得到恢復（圖3G）。綜合上述結果顯示，染色質(zhì)開(kāi)放程度在DNA復制后30分鐘開(kāi)始恢復，并在2小時(shí)后恢復到復制前的水平。

比較不同時(shí)間的啟動(dòng)子和增強子區域的repli-ATAC-seq富集峰變化（圖4A、B），發(fā)現啟動(dòng)子的開(kāi)放性恢復模式（圖4A）與整體富集峰（圖3G）的分布模式相似。而只有2%的增強子在DNA復制完成時(shí)能達到最強的信號。因此作者對增強子的恢復模式進(jìn)一步研究，將增強子分為三類(lèi)：1調節基本細胞過(guò)程的管家型增強子；2特異調節ESC細胞相關(guān)基因的ESC增強子；3作用于高度活躍的細胞特異性調控區域的強增強子。并比較三種增強子在不同時(shí)間的比例發(fā)現（圖4D、E），超級增強子在DNA復制后1小時(shí)內90%得到恢復，這可能與整體的轉錄水平相關(guān)。

染色質(zhì)的開(kāi)放程度與基因的CpG含量有關(guān)，作者比較不同恢復類(lèi)型的ATAC-SEQ中的CpG密度，發(fā)現R0峰的CpG密度最高，這可能與基因沉默相關(guān)（圖4F），同時(shí)R1峰和R2峰的在TSS區域的CpG密度比R0和R0.5的密度要高，這可能是隨著(zhù)染色質(zhì)開(kāi)放區域的增加，啟動(dòng)子附近的CpG島有更多的轉錄因子結合上去。

作者將repli-ATAC-seq富集峰分成三種模式：1立即恢復信號的立即峰；2緩慢恢復信號的緩慢峰；3瞬間恢復并在成熟期不表達的瞬時(shí)峰。結果顯示立即峰與緩慢峰主要出現在R0期，瞬時(shí)峰在早期就表現出來(lái)（圖5A）。而緩慢峰占總體比例為64%，瞬時(shí)峰占比例較少（圖5B）。將每個(gè)富集峰出現的位置進(jìn)行注釋?zhuān)⒓春途徛宓拇蟛糠质腔蜷g的，可能代表遠端順式調節元件。相反，大約75％的瞬時(shí)峰存在于基因體內，或者在內含子或外顯子中（圖5C）。立即和慢峰主要位于基因的5'末端，表明這些恢復類(lèi)別中的大多數基因峰位于啟動(dòng)子區域，瞬時(shí)峰常見(jiàn)于3'末端（圖5D）。

作者選取那些在3'末端含有瞬時(shí)峰表達的基因進(jìn)行研究，發(fā)現這些基因的長(cháng)度比平均值要長(cháng)（圖5E），并且相對表達量要高（圖5F），以及有更多的轉錄強制標記H3K36me3富集（圖5G）。對這些基因功能研究發(fā)現，這些基因與細胞周期、RNA轉錄加工途徑相關(guān)。這表明細胞基礎功能相關(guān)基因在早期就已經(jīng)完成轉錄。

六、轉錄是染色質(zhì)開(kāi)放性修復的主要驅動(dòng)因素

作者用來(lái)抑制轉錄起始的抑制劑雷公藤內酯和抑制轉錄延伸的DRB分別作用于子代細胞，研究轉錄對染色質(zhì)開(kāi)放性的影響（圖6A）。對不同處理組的repli-ATAC-seq數據顯示，子代細胞的TSS區域和增強子區域都缺乏開(kāi)放性（圖6B、C）。雷公藤內酯處理后的成熟期細胞的染色質(zhì)開(kāi)放性程度與子代細胞相似，表明轉錄起始可促進(jìn)染色質(zhì)的開(kāi)放。主成分分析結果顯示子代細胞與成熟期細胞形成兩個(gè)不同的簇，雷公藤內酯處理的成熟期細胞也單獨地形成一個(gè)簇（圖6D）。這些數據表明轉錄是染色質(zhì)開(kāi)放性修復的主要驅動(dòng)因素。

根據repli-ATAC-seq信號峰形成過(guò)程，把不同處理組按照立即峰、緩慢峰、瞬時(shí)峰分類(lèi)（圖6E）。結果顯示雷公藤內酯處理的成熟期細胞的瞬時(shí)峰富集程度最高；在緩慢峰中所有子代細胞都不能恢復到成熟期細胞的富集程度；而在立即峰中，兩種抑制劑都成熟期細胞影響較少。

這些分析表明，為了恢復染色質(zhì)穩態(tài)可及性，大多數基因組區域都需要轉錄起始和延伸。

總結

作者分析repli-ATAC-seq和ChIP-seq數據，發(fā)現新生的染色質(zhì)缺乏可接近的位點(diǎn)和RNA聚合酶II。在子傳代的2小時(shí)內，RNA聚合酶占據和染色質(zhì)開(kāi)放狀態(tài)重新建立。綜上所述，轉錄起始和延伸恢復了穩態(tài)染色質(zhì)開(kāi)放性區域。