不同的CRISPR系統

    Cas9核酸酶共有兩種突變體：Cas9 Nickase（單突變）和dCas9（雙突變）。

?Cas9 Nickase

        CRISPR Cas9技術(shù)的潛在脫靶效應可能是由Cas9核酸酶活性引起的。 為了改善由Cas9核酸酶活性引發(fā)的脫靶效應，開(kāi)發(fā)了Cas9 Nickase。 Cas9 Nickase是Cas9的突變形式， 是由RuvC1和 HNH兩個(gè)核酸酶活性區域中其中一個(gè)核酸酶活性區域突變而成。 這種突變形式產(chǎn)生單鏈缺口而不是在靶位點(diǎn)的雙鏈斷裂。（圖6）

    利用Cas9 Nickase進(jìn)行基因組編輯，需要兩個(gè)gRNA而不是一個(gè)。 兩個(gè)gRNA將被設計在相反的DNA鏈上且緊密接近（序列相距不超過(guò)20bp），以確保一旦兩條鏈被Cas9 Nickase切割時(shí)，就會(huì )產(chǎn)生DNA雙鏈斷裂。 這種配對的Cas9 Nickase減少了脫靶效應，因為兩個(gè)gRNA需要一起作用才能產(chǎn)生DNA的雙鏈斷裂（圖7）。一旦雙鏈DNA斷裂，NHEJ或HDR路徑將被激活以完成基因組編輯過(guò)程。

Figure 6 ：The Cas9 nickase is a mutant form of the Cas9 nuclease where one of its cleavage domains has been disabled. Using Cas9 Nickase, off-target effects of the wild type Cas9 can be minimize, since the nicks in the DNA rarely lead to InDel mutations.

Figure 7 ： When using paired Cas9 nickases additional considerations need to be given to the gRNA design. These include producing a 5’ overhang, the spacing between the two gRNAs, and the relative position of the two gRNA target sites.

?dCas9

    dCas9的英文為dead Cas9，即Cas9的RuvC1和 HNH兩個(gè)核酸酶活性區域同時(shí)發(fā)生突變。因此，dCas9只保留由gRNA引導進(jìn)入基因組的能力，剪切酶活性全部消失。dCas9主要是與其他效應蛋白融合（如GFP、轉錄因子、組蛋白修飾等），進(jìn)行基因調控，基因組成像，染色質(zhì)或DNA修飾以及染色質(zhì)免疫沉淀等。

Figure 8 ：The Cas9 null mutant has lost both of its DNA cleavage domains while still retaining its ability to target genomic loci through gRNA:DNA interactions. By fusing effector domains to the Cas9 null mutant, it is possible to activate gene expression (i.e. V964 or NF-kB), repress gene expression (i.e. KRBA domain), visualize genomic loci (i.e. EGFP), perform chromatin remodelling (i.e. TET proteins), and simplify chromatin immunopercipitation (through an antibody epitope tag)

    為了解決spCas9的局限性，即其大尺寸和富含G的PAM序列，已經(jīng)研究出幾種 CRISPR酶作為潛在替代物，最顯著(zhù)的是Cpf1和saCas9。表3總結了spCas9，saCas9和Cpf1之間的一些重要差異和相似之處。

Table 3: Comparison of spCas9, saCas9, and Cpf1 nucleases

?Cpf1核酸酶

     2015年末，麻省理工學(xué)院的張峰小組發(fā)現了一種新的CRISPR核酸酶Cpf1。Cpf1可以識別富含T的PAM基礎，與富含G的PAM -Cas9相比，這顯著(zhù)擴大了基因組靶標的廣度。因此，Cas9是富含G的基因組區域的首選核酸酶，而 Cpf1主要用于靶向富含T的基因組

   與Cas9相比，Cpf1的gRNA更短一些， Cas9的gRNA是約100nt的tracrRNA / crRNA雜合體，而Cpf1的gRNA是僅有42nt的 crRNA。這將gRNA的大小減少了一半以上，同時(shí)也簡(jiǎn)化了與合成和化學(xué)修飾相關(guān)的方法和節約了成本，也使得Cpf1成為復合基因組編輯的最佳選擇，即可將多個(gè)gRNA插入同一載體并進(jìn)行同步基因編輯。

      Cpf1切割位于PAM位點(diǎn)下游18-23bp的DNA， NHEJ修復斷裂的雙鏈DNA后識別序列不中斷。因此，Cpf1能夠進(jìn)行多輪DNA切割，增加了產(chǎn)生基因組編輯的機會(huì )。相比之下， Cas9在PAM位點(diǎn)上游3bp切割，NHEJ修復雙鏈DNA后識別序列會(huì )被破壞。

?saCas9核酸酶

     saCas9從金黃色葡萄球菌中分離的微型Cas9核酸酶。

     SaCas9比spCas9小約1kb，這使其能夠更有效地包裝進(jìn)較小容量的腺病毒（AAV）中，為調節元件，crRNA和tracrRNA留下額外的空間。也使得將Cas9與gRNA構建到一個(gè)載體上成為可能，稱(chēng)為All-In-One載體。

      spCas9識別5'-NGG-3'的PAM序列，而saCas9識別5'-NNGRRT-3'。PAM序列的更多變意味著(zhù)可用于基因組編輯的基因座數目增加。當需要使用同源性定向修復的基因的精確編輯時(shí)，這是特別有益的，因為當識別序列非常接近待編輯區域時(shí)HDR是最有效的。saCas9更長(cháng)的PAM的一個(gè)缺點(diǎn)是，這個(gè)序列在基因組中比spCas9的PAM序列發(fā)生基因編輯的可能性小，限制了它的潛在效用。但是，saCas9較長(cháng)的PAM序列增加了識別的特異性，有助于防止脫靶效應

• 1 . CRISPR-Cas9系統
  • 1.1. CRISPR-Cas9組成
  • 1.2. 作用機制
  • 1.3. 不同的Cas9系統
  • 1.4. Cas9-基因敲除
  • 1.5. Cas9-敲入系統
• 2 . CRSPER- dCas9系統
  • 2.1. dCas9-轉錄調控系統
  • 2.2. dCas9-基因激活與抑制系統
  • 2.3. dcas9-表觀(guān)遺傳系統
• 3 . dCas9技術(shù)路線(xiàn)
  • 3.1. gRNA設計
  • 3.2. dCas9實(shí)驗流程
  • 3.3. 實(shí)驗問(wèn)題與解決方案