CRISPR-dCas9-表觀(guān)遺傳調控系統

    表觀(guān)遺傳調節是往往是通過(guò)影響一段染色質(zhì)的結構起作用，比如將染色質(zhì)壓縮成緊密狀態(tài)（異染色質(zhì)），使基因難以轉錄，或者使染色質(zhì)打開(kāi)以促進(jìn)轉錄。表觀(guān)遺傳調節包括DNA甲基化、組蛋白甲基化、組蛋白乙?；?、組蛋白磷酸化等等。

    最近，人們將dCas9與表觀(guān)遺傳修飾酶融合在一起，形成dCas9表觀(guān)遺傳編輯系統，該系統成員如表1所示。

Table 1 - The dCas9 Epigenetics Toolbox

    組蛋白乙?；亲顝姶蟮幕虮磉_增強子系統之一。dCas9-p300的開(kāi)發(fā)，使得人們能夠直接改變靶標基因附近的染色質(zhì)狀態(tài)。在這個(gè)系統中，人類(lèi)E1A相關(guān)蛋白p300的催化核心與dCas9融合，這是組蛋白乙?；年P(guān)鍵成分（圖4a）。當靶向編碼區或啟動(dòng)子區時(shí)，這個(gè)系統可成功誘導基因高表達。特別是，當靶向啟動(dòng)子或增強子時(shí)，基因表達可增強50至10,000倍（圖4b）。通過(guò)轉錄組分析評估得到，基因激活是高度特異性的。這表明該系統可以精確調控某段染色質(zhì)的變化。

    dCas9-p300是一種簡(jiǎn)單而獨特的工具，可用于研究調控元件和靶基因表達之間的復雜關(guān)系。

Figure 4 ：The dCas9-p300 system for epigenetic activation. a) dCas9 fused to the core catalytic domain of p300 can acetylate target sites in the genome. Acetylation of the target gene synergizes with the action of transcription factors and RNA Polymerase II, resulting in transcriptional upregulation. Adapted from Figure 1b of Zentner et al. (2015). b) Comparison of relative expression levels of IL1RN when dCas9 by itself vs. dCas9 fused to the p300 catalytic core is targeted to the IL1RN promoter. Relative expression levels determined by qRT-PCR. Adapted from Figure 1c of Hilton et al. (2015).

    dCas9-LSD1是dCas9-p300激活系統的互補基因抑制系統。在該系統中，dCas9與賴(lài)氨酸特異性組蛋白去甲基化酶1（LSD1）融合（圖5a）。 Kearns等人在穩定表達dCas9-LSD1的小鼠胚胎干細胞系中，設計Oct4基因的遠端增強子區域的gRNA，Oct4基因被抑制（12）。然而，當dCas9-LSD1針對Oct4啟動(dòng)子時(shí)，沒(méi)有觀(guān)察到效果。這使得dCas9-LSD1成為研究增強子調控活性的工具。這與其他系統如dCas9-KRAB（它們是更全面的基因表達控制器）互補。當靶向上游增強子時(shí)，dCas9-LSD1也能夠使下游基因表達沉默（圖5b）（12），而不破壞基因組結構。

    由于在增強子區域內發(fā)現了與人類(lèi)疾病相關(guān)的許多基因組區域，因此dCas9-LSD1以高度特異的方式功能性地靶向增強子元件的能力使其在定義增強子 - 基因關(guān)系方面具有無(wú)價(jià)之寶。當與增強子靶向的sgRNA池組合使用時(shí)，該系統可以提供高通量的方式來(lái)鑒定與基因相關(guān)的所有增強子。

Figure 5 ： The dCas9-LSD1 system for epigenetic repression. a) dCas9 fused to LSD1 can demethylate target sites in the genome. Demethylation of the target gene results in transcriptional downregulation. Adapted from Figure 1b of Zentner et al. (2015). b) The relative expression level of the TBX3 gene was assessed via quantitative PCR analysis when the sgRNA of the dCas9-LSD1 system was fused with a distal enhancer vs. a promoter. sgRNAs specific to an unrelated genomic region were used as controls. Adapted from Figure 1e of Kearns et al. (2015).

    哺乳動(dòng)物細胞中的靶向DNA甲基化主要發(fā)生在CpG二核苷酸序列內胞嘧啶的第五個(gè)碳上。細胞發(fā)育，分化和腫瘤都可以通過(guò)DNA甲基化來(lái)調節，高甲基化與癌癥和神經(jīng)系統疾病密切相關(guān)。使DNA甲基化易于調節的技術(shù)可以直接探索甲基化狀態(tài)和基因表達之間的功能關(guān)系，甚至可以開(kāi)發(fā)治療疾病的療法。

    dCas9-Tet1-CD是以這種方式編輯表觀(guān)基因組的新技術(shù)之一。該系統由與Tet1（十 - 十一易位甲基胞嘧啶雙加氧酶1）的催化結構域（CD）融合dCas9組成，該酶觸發(fā)DNA去甲基化（圖6a）。伴隨的sgRNA也可以進(jìn)行修飾，使之包含一個(gè)MS2二聚體，每個(gè)二聚體再與兩個(gè)Tet1-CD模塊融合。有研究表明，該系統轉染后4天后觀(guān)察到基因的激活（圖6b）。在不同的人和小鼠細胞系中，結合精確的sgRNA設計和控制該系統不同組分的比例，dCas9-Tet1-CD系統及其伴隨的MS2-Tet1-CD系統能夠在特定位置有效去甲基化，且具有很小的脫靶效應。

dCas9-Tet1-CD系統地靶向特異性將幫助科學(xué)家輕易地探索特定基因啟動(dòng)子靶點(diǎn)甲基化對下游基因的影響。最近，dCas9-Tet1-CD系統結合常規sgRNA也被用于靶向BRCA1啟動(dòng)子的表觀(guān)遺傳修飾，BRCA1是一種腫瘤抑制基因，其過(guò)度甲基化沉默與非家族性乳腺癌和卵巢癌相關(guān)。這樣的系統也可以用來(lái)恢復其他腫瘤抑制基因的功能活性。

Figure 6 ： The dCas9-TET1-CD system for targeted DNA demethylation. a) dCas9 is fused to the catalytic domain of TET1 (TET1-CD). The accompanying sgRNA is additionally modified to contain two RNA aptamers that recruit MS2 coat proteins, each fused to a TET1-CD. Adapted from Figure 1a of Xu et al. (2016). b) qRT-PCR was used to assess mRNA levels of RANKL gene expression using two sgRNAs designed to target the RANKL promoter region (-800 bp upstream of transcription start site). Adapted from Figure 2c of Xu et al. (2016).

    與基于組蛋白的細胞表型控制不同，DNA甲基化對基因表達的作用更穩定和長(cháng)期?；?/span>dCas9的甲基化系統不僅具有跨物種能力，而且對CpG甲基化不敏感。

    dCas9-DNMT3A是先前討論的dCas9-Tet1-CD系統的甲基化對應物。由Vojta等開(kāi)發(fā)，該系統是dCas9（通過(guò)靈活的Gly4Ser接頭）與DNMT3A的催化結構域（一種能夠在體內甲基化CpG位點(diǎn)的活性DNA甲基轉移酶）融合。這個(gè)dCas9-DNMT3A系統在HEK293細胞中成功地誘導BACH2啟動(dòng)子上游和下游的位點(diǎn)特異性CpG甲基化，最高濃度的甲基化活性（60％）位于PAM序列下游27bp處。當針對IL6ST啟動(dòng)子時(shí)，轉染后10天后兩種基因的表達水平均顯著(zhù)降低。此外，通過(guò)dCas9-DNMT3A與sgRNA池結合同時(shí)靶向多個(gè)基因特異性位點(diǎn)導致甲基化的協(xié)同作用，將甲基化提高2倍，擴大該系統的基因沉默能力。

    自其發(fā)展以來(lái)，dCas9-DMNT3A也被用于多種癌癥相關(guān)的腫瘤抑制基因的啟動(dòng)子的甲基化如（CDKN1A和2A啟動(dòng)子甲基化）。該項研究表明，CDKN1A啟動(dòng)子的甲基化導致CDKN1A的表達下降和細胞增殖能力的增加，進(jìn)一步證明了該系統用于功能基因組學(xué)研究。

Figure 7 ：The dCas9-DNMT3A system for targeted DNA methylation. a) dCas9 is fused to the catalytic domain of DNMT3A. In vivo, DNMT3A recruits a partner for dimerization along with DNMT3L proteins (shown in dashed red box and ovals, respectively). Adapted from Figure 1a of Vojta et al. (2016). b) RT-qPCR analysis of IL6ST gene expression via dCas9-fused to active DMNT3A. Expression levels induced by dCas9 fused to inactive DMNT3A along with dCas9 accompanied by non-targeting sgRNAs were measured as negative controls. Fold change is relative to mock-transfected cells. Adapted from Figure 4a of Vojta et al. (2016).

• 1 . CRISPR-Cas9系統
  • 1.1. CRISPR-Cas9組成
  • 1.2. 作用機制
  • 1.3. 不同的Cas9系統
  • 1.4. Cas9-基因敲除
  • 1.5. Cas9-敲入系統
• 2 . CRSPER- dCas9系統
  • 2.1. dCas9-轉錄調控系統
  • 2.2. dCas9-基因激活與抑制系統
  • 2.3. dcas9-表觀(guān)遺傳系統
• 3 . dCas9技術(shù)路線(xiàn)
  • 3.1. gRNA設計
  • 3.2. dCas9實(shí)驗流程
  • 3.3. 實(shí)驗問(wèn)題與解決方案