gDNA設計

       CRISPR Cas9系統只需設計一個(gè)包含20個(gè)堿基對的RNA寡核苷酸，即可靶向任何基因組位點(diǎn)。gRNA是CRISPR Cas9系統的重要組成部分，在設計gRNA序列時(shí)需要考慮諸多因素。

    在細菌和古細菌中，CRISPR RNA（crRNA）和反式激活CRISPR RNA（tracrRNA）形成一個(gè)復合體，作為引導Cas9核酸酶降解外來(lái)遺傳物質(zhì)的引導裝置。 我們將tracrRNA和crRNA結合成一個(gè)單一的合成的gRNA，這個(gè)單組分系統不僅簡(jiǎn)化了實(shí)驗設計，而且還產(chǎn)生了相同或更高的導向效率（圖1）。最常用的gRNA長(cháng)約100個(gè)堿基對。 通過(guò)gRNA的5'端的特異性的20個(gè)堿基對（藍色區域），CRISPR Cas9系統可以靶向與該序列互補的任何基因組區域。

Figure 1 ：An example of the crRNA-tracrRNA complex and a gRNA

       CRISPR Cas9系統的靶向特異性由gRNA 5'末端的20個(gè)核苷酸序列決定。 對于化膿性鏈球菌CRISPRCas9系統，所需的靶序列必須緊接在5'-NGG PAM基序（間隔子相鄰基序）之前，因此設計的序列為“20N+NGG3”。 gRNA通過(guò)互補堿基配對將Cas9核酸酶引導至靶序列，并且Cas9核酸酶使PAM序列上游?3個(gè)核苷酸處雙鏈DNA斷裂（圖2）

Figure 2： For the S. pyogenes system, the target sequence must be immediately adjacent to a 5’-NGG PAM sequence. The gRNA will form complementary base paring with the opposite strand of the target sequence and mediate a double strand break ~3bp upstream of the PAM sequence through the Cas9 nuclease.

      由于一些啟動(dòng)子可以限制靶點(diǎn)選擇和gRNA設計，因此選擇合適的啟動(dòng)子驅動(dòng)gRNA表達是必要的。 例如，依賴(lài)于RNA聚合酶III的U6啟動(dòng)子或T7啟動(dòng)子分別在RNA序列的5'端需要G或GG來(lái)啟動(dòng)轉錄。 因此，如果U6或T7啟動(dòng)子用于釀膿鏈球菌CRISPR系統中，那么靶序列分別限于下列形式：GN16-19NGG或GGN15-18NGG。 然而，通過(guò)將額外的G或GG添加到20個(gè)堿基對序列的5'末端（圖3），可以繞過(guò)這個(gè)限制。

Figure 3 – Sequence restrictions imposed by the use of U6 or T7 RNA polymerase III promoters for gRNA expression can be by passed as illustrated here.

?在設計gRNA的20個(gè)堿基對的引導序列時(shí)，應考慮以下三點(diǎn)：

       1）GC含量：典型的范圍在GC含量為40％-80％之間，其中GC含量較高的RNA更容易造成脫靶; 

       2）長(cháng)度：長(cháng)度可以調節，范圍從17-24堿基對，較短的序列導致最小的脫靶效應；

       3）避免gRNA的潛在脫靶位點(diǎn)。

?gRNA與靶位點(diǎn)之間的錯配耐受性可導致CRISPR Cas9系統的脫靶效應，并且通常其發(fā)生取決于以下因素：

       ①.脫靶效應與gRNA的序列，其中一些gRNA對錯配的耐受性比其它gRNA更小。

       ②.引入細胞的Cas9和gRNA之間的比例和比率也影響脫靶效應，小心地滴定Cas9和gRNA可以降低這些效應。

       ③. 通過(guò)非同源末端連接（NHEJ）途徑進(jìn)行基因沉默時(shí)，靶點(diǎn)需更接近于蛋白質(zhì)編碼區的N'端以產(chǎn)生最大的基因破壞。

       ④.基因組DNA的編碼鏈和非編碼鏈都可以被靶向，因為它們在產(chǎn)生突變方面同樣有效。

       ⑤如果基因組編輯需要同源性定向修復（HDR），則目標位點(diǎn)的選擇受到期望的插入位置的限制。

       在設計gRNA時(shí)，需要認真考慮上面列出的各種要求。精心設計的gRNA將會(huì )產(chǎn)生更高的編輯效率和最小化脫靶效應。

       當使用成對的Cas9切口酶誘導的雙鏈斷裂時(shí)需要進(jìn)一步考慮。注意以下幾點(diǎn)很重要（圖4）：

       ⅰ.理想情況下，切割時(shí)需要產(chǎn)生5'懸垂鏈。

       ⅱ.兩個(gè)gRNA之間的距離不超過(guò)20個(gè)堿基。

       ⅲ.兩個(gè)gRNA需要在相反鏈上設計靶序列。 請注意，PAM序列需要在目標序列的上游。

       在設計了兩種gRNA之后，它們可以以1：1的比例混合，并與Cas9 Nickase一起轉染的細胞中。

Figure 4 ：When using paired Cas9 nickases additional considerations need to be given to the gRNA design. These include producing a 5’ overhang, the spacing between the two gRNAs, and the relative position of the two gRNA target sites.

       有許多工具可以幫助我們設計gRNA的過(guò)程。在這里，我們將重點(diǎn)介紹兩個(gè)這樣的工具：Chop Chop Harvard和CRISPR Design。

?.Chop Chop Harvard

       將一段感興趣基因序列或登錄號碼輸入到Chop Harop Harvard（圖5），軟件分析序列并鑒定緊接著(zhù)PAM序列（5'-NGG）的所有可能的20bp序列。然后根據預先設定的代碼對GC進(jìn)行評分，該代碼查看GC含量和潛在脫靶位點(diǎn)，并將它們從最佳得分排列到最低得分。有關(guān)特定gRNA的更多信息，只需在gRNA序列上單擊即可。這將打開(kāi)顯示該特定gRNA的潛在脫靶位點(diǎn)的頁(yè)面，甚至提供可用于通過(guò)SURVEYOR測定來(lái)篩選這些脫靶位點(diǎn)潛在突變的引物序列。

Figure 5 ：The Chop Chop Harvard results page highlighting the ranking, exon position, and potential off target site counts.

?.CRISPR Design

       使用CRISPR Design的主要優(yōu)勢在于能夠提供所有潛在gRNA的脫靶目標的詳細信息。 它使每一個(gè)gRNA序列都發(fā)生了突變，并提供了關(guān)于其脫靶位置和與設計的gRNA錯配數目的詳細報告。 當設計兩個(gè)gRNAs用于配對的內切酶活性時(shí)，該軟件也是優(yōu)越的，因為它會(huì )自動(dòng)發(fā)現兩個(gè)彼此靠近的gRNA。

       然而，這個(gè)軟件的主要缺點(diǎn)是它一次只能分析500個(gè)堿基對的序列。 因此，我們建議使用Chop Chop Harvard選擇潛在的gRNA序列，然后推薦進(jìn)一步的分析用CRISPR Design工具。

• 1 . CRISPR-Cas9系統
  • 1.1. CRISPR-Cas9組成
  • 1.2. 作用機制
  • 1.3. 不同的Cas9系統
  • 1.4. Cas9-基因敲除
  • 1.5. Cas9-敲入系統
• 2 . CRSPER- dCas9系統
  • 2.1. dCas9-轉錄調控系統
  • 2.2. dCas9-基因激活與抑制系統
  • 2.3. dcas9-表觀(guān)遺傳系統
• 3 . dCas9技術(shù)路線(xiàn)
  • 3.1. gRNA設計
  • 3.2. dCas9實(shí)驗流程
  • 3.3. 實(shí)驗問(wèn)題與解決方案