CRISPR dCas9—基因激活與抑制系統

   在第一代dCas9-SAM系統中，dCas9與典型的轉錄激活因子如VP64（單純性皰疹病毒蛋白16的合成四聚體）或p65（參與許多細胞過(guò)程的轉錄因子）融合。這個(gè)系統可以在多種真核細胞的全基因組范圍內進(jìn)行基因激活，但只有中等程度的激活（2-5倍）。

   為了增強激活能力，開(kāi)發(fā)了二代dCas9-SAM系統。該系統建立在基本的dCas9-VP64結構上，但其中的sgRNA是經(jīng)修飾過(guò)的，可以募集額外的轉錄激活因子以達成協(xié)同激活作用。這種修飾的sgRNA包含了兩段可結合噬菌體MS2外殼蛋白二聚體的發(fā)卡結構。 MS2蛋白與另外的活化劑如p65和人熱休克因子1（HSF1）融合，這使得每個(gè)dCas9分子可以募集13個(gè)活化分子（圖2a）。這個(gè)新的dCas9-SAM系統可以可靠地將基因表達從10倍增加到幾千倍（圖2b）。由于這個(gè)系統需要設計修飾的sgRNA，人們開(kāi)發(fā)了第三代dCas9-SAM系統，也稱(chēng)為dCas9-VPR系統。這個(gè)系統由VP64，p65和RTA融合而成，且不需要修改的sgRNA。因此，這大大簡(jiǎn)化了設計過(guò)程。當與sgRNA文庫結合使用時(shí)，該系統還能夠支持大規模的全基因組功能激活，使其成為研究生物學(xué)過(guò)程和途徑的有力工具。

   dCas9-SAM系統是一種，在不改變內源基因組的條件下，可以選擇性地上調特定靶基因表達的簡(jiǎn)便方法。由于其強大的激活能力，該系統將成為跨越多種細胞類(lèi)型的治療性干預、基因篩選工具。研究人員已經(jīng)開(kāi)始利用dCas9-SAM系統激活HIV-1轉錄，誘導細胞凋亡以及誘導休HIV-1前病毒休眠。

Figure 2 ： The dCas9-SAM transcriptional activation system. a) The dCas9-SAM system is made up of a dCas9 fused to the transcriptional activator, VP64. The accompanying sgRNA can also be modified to contain two RNA aptamers for binding with MS2 coat proteins that are also fused to one p65 and one HSF1 transcription activator. Adapted from Figure 1f of La Russa et al. (2015). b) A comparison of the activation efficiency of dCas9-VP64 by itself (yellow) as well as with the modified sgRNA system (green) in the activation of four different genes: HBG1, IL-1B, IL1R2, and ZFP42. Relative expression levels were quantified using qPCR, with fold changes determined by comparing with GFP-transfected cells. Adapted from Figure 1b of Konermann et al. (2015). c) The dCas9-VPR system is composed of an ordered fusion of transcriptional activators VP64, p16, and RTA. This system does not require a specially modified sgRNA to achieve the same activation capability as the dCas9-SAM system. Adapted from Figure 1a of Chavez et al. (2016). d) A comparison of the activation performance of dCas9-VP64, dCas9-VPR, and dCas9-SAM of the RHOXF2 gene

   單獨的dCas9與靶位點(diǎn)的結合在空間上可以干擾轉錄酶的結合，起到抑制靶向基因轉錄的作用，這一過(guò)程稱(chēng)為CRISPRi（或CRISPR干擾）。這個(gè)簡(jiǎn)單的CRISPRi系統可以高達1000倍抑制，有效敲低細胞中的基因表達。雖然這個(gè)系統在細菌、酵母和其他原核細胞中的表現相當好，但它在抑制哺乳動(dòng)物細胞中的基因表達方面效果較差。

   因此我們開(kāi)發(fā)了dCas9-KRAB系統，在這個(gè)系統中，dCas9與Kox1的轉錄阻遏物結構域KRAB（Krüppel-associated box）融合（圖3a）。這種增強的CRISPRi系統依靠KRAB募集各種各樣的組蛋白修飾因子，通過(guò)形成異染色質(zhì)的方式可逆地抑制基因表達。該系統，在瞬時(shí)轉染期間可以高度特異性地使內源性真核基因表達降低60-80％（圖3b）。此外，在HeLa細胞中，穩定整合到基因啟動(dòng)子區域的dCas9-KRAB可以使內源性基因產(chǎn)生5-10倍的抑制作用，當靶位點(diǎn)位于轉錄起始位點(diǎn)下游50-100bp時(shí)可產(chǎn)生100倍的抑制效應。 dCas9-KRAB對細胞生長(cháng)沒(méi)有影響，使其成為無(wú)毒的基因沉默方法。

   不同于其他經(jīng)典的基因沉默方法，如RNAi（一種通過(guò)降解細胞質(zhì)中mRNA來(lái)敲低基因表達的方法），dCas9-KRAB系統在DNA水平上提供可抑制。這使得高度特異性抑制非編碼RNA，miRNA，反義轉錄物和核定位的RNA成為可能。

Figure 3 ：The dCas9-KRAB transcriptional repression system. a) dCas9 can be fused to KRAB, a transcriptional repressor. Adapted from Shalem et al. (2015). b) A comparison of relative CD71 expression levels in a dCas9 (blue) vs. a dCas9-KRAB (red) system targeted to CD71 using three different sgRNAs. Relative expression levels were determined from flow cytometry for CD71 protein expression. Adapted from Figure 3c of Gilbert et al. (2013).

• 1 . CRISPR-Cas9系統
  • 1.1. CRISPR-Cas9組成
  • 1.2. 作用機制
  • 1.3. 不同的Cas9系統
  • 1.4. Cas9-基因敲除
  • 1.5. Cas9-敲入系統
• 2 . CRSPER- dCas9系統
  • 2.1. dCas9-轉錄調控系統
  • 2.2. dCas9-基因激活與抑制系統
  • 2.3. dcas9-表觀(guān)遺傳系統
• 3 . dCas9技術(shù)路線(xiàn)
  • 3.1. gRNA設計
  • 3.2. dCas9實(shí)驗流程
  • 3.3. 實(shí)驗問(wèn)題與解決方案