實(shí)驗問(wèn)題與解決方案

◆1怎樣避免sgRNA脫靶?

脫靶效應與sgRNA的精確設計有著(zhù)密切的關(guān)系，一般的sgRNA設計網(wǎng)站都會(huì )給出設計序列相應的脫靶位點(diǎn)、GC含量或綜合得分，我們一定要選擇綜合得分高和脫靶位點(diǎn)少的sgRNA序列，且一般至少設計3條sgRNA。

◆2怎樣選擇CRISPR系統？

如果要靶標多個(gè)基因位點(diǎn)，建議您選擇CRISPR-cpf1系統，這個(gè)系統的sgRNA只有40多bp，比普通Cas9蛋白的sgRNA要小一半以上，一個(gè)sgRNA載體可同時(shí)插入多個(gè)sgRNA。

如果要更精確的編譯基因組，建議選擇Cas9 nicknase，這個(gè)蛋白是Cas9的突變體，只切割DNA的一條鏈，因此，這個(gè)系統需要設計兩個(gè)sgRNA，同時(shí)切割，才能產(chǎn)生DNA雙鏈缺口。同時(shí)，這種方法大大降低了脫靶效應。

◆3 Cas9的單切系統和雙切系統是什么？

Cas9的雙切系統是未突變的Cas9內切酶，Cas9內切酶可以切割雙鏈DNA。Cas9

的單切系統使用的是單突變Cas9內切酶，即Cas9 Nicknase，Cas9 Nicknase需要兩套才可以切割雙鏈DNA。

◆4 怎樣選擇CRISPR系統的質(zhì)粒？

 如果您的細胞的轉染效率較高，可使用普通載體，如果您的細胞不容易轉染，建議使用腺病毒或慢病毒載體。

• 1 . CRISPR-Cas9系統
  • 1.1. CRISPR-Cas9組成
  • 1.2. 作用機制
  • 1.3. 不同的Cas9系統
  • 1.4. Cas9-基因敲除
  • 1.5. Cas9-敲入系統
• 2 . CRSPER- dCas9系統
  • 2.1. dCas9-轉錄調控系統
  • 2.2. dCas9-基因激活與抑制系統
  • 2.3. dcas9-表觀(guān)遺傳系統
• 3 . dCas9技術(shù)路線(xiàn)
  • 3.1. gRNA設計
  • 3.2. dCas9實(shí)驗流程
  • 3.3. 實(shí)驗問(wèn)題與解決方案