CRISPR-Cas9-基因敲除系統（knock out）

實(shí)驗原理：

       CRISPR-Cas9基因敲除系統是Cas9內切酶切割雙鏈DNA，生物體啟動(dòng)NHEJ修復途徑，切割位點(diǎn)產(chǎn)生移碼突變，導致基因沉默。

NHEJ修復途徑是一種錯誤傾向修復機制，用于在缺少修復模板的情況下修復斷裂的雙鏈DNA。該途徑主要用于CRISPR Cas9系統介導的基因沉默。主要用于當DNA發(fā)生斷裂時(shí)，NHEJ修復途徑被開(kāi)啟，DNA斷裂處插入或缺失幾個(gè)堿基，然后雙鏈DNA的切割末端連接在一起，這個(gè)過(guò)程極容易導致切割位點(diǎn)發(fā)生移碼突變，從而沉默該基因（圖3）。因此，在沉默編碼基因時(shí)， gRNA應靶向基因的N端來(lái)確保最大程度的基因破壞。

實(shí)驗流程：

      1.設計sgRNA

      2.構建sgRNA-Cas9載體

      3.構建sgRNA-Cas9穩轉株

      4 .篩細胞克隆并進(jìn)行qPCR驗證

      5 .陽(yáng)性克隆測序，選擇敲除純合細胞株

      6 .篩選細胞單克隆測序

實(shí)驗步驟：

   ? 1、設計sgRNA

    針對小鼠LIF基因座（Mus musculus，NM_008501）設計了三種sgRNA。 進(jìn)行軟件分析以確保sgRNA沒(méi)有預測的脫靶結合位點(diǎn)。

   ? 2、構建sgRNA-Cas9載體

      然后將選擇的sgRNA設計克隆到pLenti-U6-sgRNA-SFFV-Cas9-2A-Puro All-in-One lentivector中（圖1）。

圖1 sgRNA-Cas9載體圖譜

   ? 3、構建sgRNA-Cas9穩轉株

  利用慢病毒包裝體系構建sgRNA-Cas9穩轉株，進(jìn)行嘌呤篩選

   ? 4、 篩細胞克隆并進(jìn)行qPCR驗證

   嘌呤霉素篩選后分離細胞克隆。 提取基因組DNA并進(jìn)行驗證測定目的基因座是否進(jìn)行編輯.

圖2 qPCR檢測基因組編輯情況。在野生型（WT）測定中的單個(gè)條帶表示沒(méi)有發(fā)生編輯; 兩個(gè)較小的條帶（總和WT的長(cháng)度）表示編輯已經(jīng)發(fā)生。圖2表明，克隆 3和6編輯; 克隆2沒(méi)有編輯; 克隆1是不確定的。

   ?5 、陽(yáng)性克隆測序，選擇突變細胞株

   通過(guò)Sanger測序進(jìn)一步分析細胞集落3和6的PCR產(chǎn)物以確定敲除的性質(zhì)（圖3）。

圖3 細胞基因組測序結果。對于細胞集落3，只檢測到一個(gè)突變序列，表明這些細胞可能只是雜合敲除。 在菌落6中檢測到兩種不同的突變序列。

   ? 6 、篩選細胞選擇單克隆純合突變細胞株

將菌落6連續稀釋到96孔板中進(jìn)行單克隆選擇。 從這些克?。?/span>6a，6b ..）中提取基因組DNA，進(jìn)行PCR擴增，克隆和測序。

 圖4細胞基因組測序結果。測序顯示，在兩個(gè)等位基因中只有克隆6a具有移碼突變（圖4）。 移碼突變破壞了開(kāi)放閱讀框架，導致無(wú)意義介導的mRNA。

   ? 7.進(jìn)一步測序，確定純合突變

圖5 細胞基因組測序結果

• 1 . CRISPR-Cas9系統
  • 1.1. CRISPR-Cas9組成
  • 1.2. 作用機制
  • 1.3. 不同的Cas9系統
  • 1.4. Cas9-基因敲除
  • 1.5. Cas9-敲入系統
• 2 . CRSPER- dCas9系統
  • 2.1. dCas9-轉錄調控系統
  • 2.2. dCas9-基因激活與抑制系統
  • 2.3. dcas9-表觀(guān)遺傳系統
• 3 . dCas9技術(shù)路線(xiàn)
  • 3.1. gRNA設計
  • 3.2. dCas9實(shí)驗流程
  • 3.3. 實(shí)驗問(wèn)題與解決方案