CHIRP 免疫共沉淀實(shí)驗

CHIRP(Chromatin Isolation by RNA Purification)是一種檢測體內與RNA綁定的DNA和蛋白相互作用的方法，可同時(shí)分析lncRNA/circRNA 、蛋白及DNA三者互作關(guān)系。利用ChIRP-seq技術(shù)可用于在全基因范圍內定位lncRNA/circRNA的結合位點(diǎn)和可能結合的其他RNA分子,是揭示位于細胞核內lncRNA/circRNA 生物學(xué)機制的關(guān)鍵實(shí)驗手段。該方法是通過(guò)設計與目標RNA序列反向互補的生物素探針，把目標RNA拉下來(lái)以后，與其共同作用的DNA染色體片段就會(huì )附到鏈霉親和素磁珠上，最后通過(guò)qRT-PCR或測序來(lái)測定目的RNA、DNA序列，亦或是通過(guò)Western或質(zhì)譜分析來(lái)測定蛋白

技術(shù)優(yōu)勢：

（1）、CHIRP實(shí)驗可研究細胞體內互作；

（2）、CHIRP實(shí)驗既同時(shí)可研究RNA、蛋白質(zhì)和DNA形成的復合體之間的互作；也可研究它們之間的兩兩互作；

（3）、利用CHIRP-MS實(shí)驗尋找與目的lncRNA結合的蛋白，可不受lncRNA長(cháng)度的限制；

（4）、利用CHIRP實(shí)驗可研究circRNA與蛋白質(zhì)或DNA之間的互作。

技術(shù)流程：

（1）、CHIRP-RNA：探針設計與合成→細胞交聯(lián)→細胞裂解、超聲處理→探針雜交→復合物純化→RNA回收與純化→NGS或qRT-PCR檢測；

（2）、CHIRP-DNA：探針設計與合成→細胞交聯(lián)→細胞裂解、超聲處理→探針雜交→復合物純化→DNA回收與純化→NGS或qPCR檢測；

（3）、CHIRP-Protein：探針設計與合成→細胞交聯(lián)→細胞裂解、超聲處理→探針雜交→復合物純化→蛋白分離→質(zhì)譜鑒定。

ChIRP實(shí)驗標準實(shí)驗分組如下：

（1）、IP組：目標lncRNA/circRNA Odd組和Even組（即實(shí)驗組，用于鑒定lncRNA/circRNA作用基因組位置）

（2）、lacZ組：外參對照組，證明ChIRP探針的特異性；

（3）、Input組：捕獲前分離提取的基因組DNA，作為內參對照組，證明探針特異性；

（4）、Positive組：陽(yáng)性對照組，通過(guò)已知驗證有效的探針，通過(guò)WB檢測已知結合蛋白質(zhì)，證明整個(gè)ChIRP實(shí)驗體系的有效性；

（5）、目標lncRNA/circRNA qPCR：證明ChIRP探針對目標lncRNA的正確結合及有效捕獲。

案例分析：

案列1：ChRIP-protein研究

結果解析：圖A展示的整個(gè)ChIRP-WB或ChIRP-MS實(shí)驗大致的實(shí)驗流程；圖B闡述的是ChIRP實(shí)驗中U1探針和U2探針富集到的RNA長(cháng)度分布，結果顯示，input組的RNA大小為150-4000nt不等，而U1探針和U2探針富集的RNA長(cháng)度為150-200nt，說(shuō)明U1探針和U2探針能有效地富集樣本中的U1和U2；圖C是U1、U2、U3的ChIRP-WB實(shí)驗結果，實(shí)驗結果證明，U1和U2可與U1A蛋白結合，U3可與FIBRILLARIN蛋白結合。

參考文獻：Systematic discovery of Xist RNA binding proteins，figuer1.

案列2：ChRIP-DNA研究

結果解析：圖A展示的是通過(guò)生物信息學(xué)分析，預測出lncRNA FOXD2-AS1與TRIB3 Promoter的三個(gè)結合位點(diǎn)；圖B是lncRNA FOXD2-AS1在UM-UC-3細胞中進(jìn)行ChIRP-qPCR實(shí)驗結果；圖C是ChIRP實(shí)驗中lncRNA FOXD2-AS1的奇數探針和偶素探針的富集效率檢測結果。綜合實(shí)驗結果表明，lncRNA FOXD2-AS1可與TRIB3 Promoter結合，且結合位點(diǎn)位于預測位點(diǎn)的P3位點(diǎn)。

參考文獻：The long non-coding RNA FOXD2-AS1 promotes bladder cancer progression and recurrence through a positive feedback loop with Akt and E2F1，figuer6.

案列3：ChRIP-circRNA-protein研究

結果解析：圖a展示的是圖b、c、d實(shí)驗的簡(jiǎn)單實(shí)驗流程圖；圖b是利用circRNA探針進(jìn)行的類(lèi)似ChIRP實(shí)驗原理的RNA pulldown結果；圖c是對圖a的circRNA-RNA pulldown產(chǎn)物進(jìn)行qPCR的實(shí)驗結果；圖d是利用circRNA探針進(jìn)行ChIRP-qPCR實(shí)驗結果。綜合實(shí)驗結果表明，circEIF3J和circPAIP2能與RNA聚合酶復合體結合，也能與本身目基因啟動(dòng)子結合從而調控母基因的表達水平。

參考文獻：Exon-intron circular RNAs regulate transcription in the nucleus，figuer5.

案列4：ChRIP-circRNA-miR研究

結果解析：圖A展示的是circPVT1與microRNA結合位點(diǎn)的預測結果；圖B是類(lèi)似ChIRP實(shí)驗原理的circRNA pulldown原理圖；圖C是對circRNA-RNA pulldown產(chǎn)物進(jìn)行circPVT1的qPCR的實(shí)驗結果，該結果反映的是circPVT1探針的有效性；圖D是circRNA-RNA pulldown產(chǎn)物進(jìn)行microRNA qPCR檢測的實(shí)驗結果。綜合實(shí)驗結果表明，circPVT1能與has-let-7有效結合，從而達到富集細胞內的游離的has-let-7，進(jìn)而間接調控has-let-7的下游靶基因。

參考文獻：Identification of senescence-associated circular RNAs(SAC-RNAs) reveals senescence suppressor CircPVT1，figuer4.

樣本要求：

細胞數量：細胞數量需要達到108個(gè)；提供活細胞樣本。

實(shí)驗周期：

50個(gè)工作日。

公司提供：

實(shí)驗報告（材料、試劑、儀器、方法、數據分析、實(shí)驗結果）。

其他注意事項：

1、目標lncRNA/circRNA的表達豐度：

2、如果目標lncRNA/circRNA表達豐度較低，需要進(jìn)行過(guò)表達以確保ChIRP成功；

• 1 . 基因表達調控
  • 1.1. 表觀(guān)遺傳修飾調控
  • 1.2. 轉錄水平調控
  • 1.3. 轉錄后水平調控
• 2 . 基因表達調控實(shí)驗技術(shù)
  • 2.1. CHIP 染色質(zhì)免疫沉淀技術(shù)
  • 2.2. RIP RNA結合蛋白免疫沉淀技術(shù)
  • 2.3. CHIRP 免疫共沉淀實(shí)驗
  • 2.4. CLIP實(shí)驗技術(shù)
  • 2.5. RNA pull-down
  • 2.6. DNA pull-down
  • 2.7. RNA-RNA pull-down
  • 2.8. Luciferase 熒光素酶實(shí)驗
  • 2.9. DNA/RNA EMSA 凝膠電泳遷移實(shí)驗
  • 2.10. FISH 免疫熒光原位雜交技術(shù)
  • 2.11. ?核質(zhì)分離