FISH 免疫熒光原位雜交技術(shù)

免疫熒光原位雜交是在組織、細胞等水平上對蛋白、DNA或RNA進(jìn)行定性、定位和定量分析的實(shí)驗技術(shù)。

1、RNA FISH

用已知的熒光標記單鏈核酸為探針，按照堿基互補的原則，與待檢材料中未知的單鏈核酸進(jìn)行異性結合，形成可被檢測的雜交雙鏈核酸，通過(guò)激光激發(fā)產(chǎn)生熒光來(lái)檢測目標核酸。

在RNA-FISH實(shí)驗過(guò)程中我們設置一系列的質(zhì)控標準以確保每一步實(shí)驗的真實(shí)有效，如探針模板DNA片段PCR擴增跑膠圖、體外轉錄產(chǎn)物跑膠圖。具體示例如下圖所示：

探針跑膠圖，泳道一為探針體外轉錄模板DNA，泳道二為體外轉錄標記的RNA探針。

RNA-FISH結果示例：

上圖為RNA-FISH結果示例，是對細胞內LncRNA BCAR4的定位，以actin mRNA作為內參，以SCR作為陰性對照。從圖可看出LncRNA BCAR4位于細胞核內。

2、蛋白FISH

用目的蛋白抗體與細胞進(jìn)行孵育，然后用帶熒光標記的二抗孵育檢測細胞內蛋白表達和定位。

蛋白FISH示例：

上圖為蛋白FISH結果的一個(gè)示例，檢測的是LncRNA正常表達細胞和過(guò)量表達細胞中的Vimentin蛋白，E1和E2組是LncRNA正常表達的細胞，OC1和OC2是LncRNA過(guò)量表達的細胞。從上圖可清晰的看到LncRNA過(guò)量表達的細胞Vimentin蛋白明顯高于正常表達的細胞。

   3、RNA-蛋白FISH

用已知的熒光標記單鏈核酸為探針，按照堿基互補的原則，與待檢材料中未知的單鏈核酸進(jìn)行異性結合，形成可被檢測的雜交雙鏈核酸，然后用目的蛋白抗體與細胞進(jìn)行孵育，用帶熒光標記的二抗孵育檢測細胞內RNA和蛋白的表達和互作定位。

在RNA-蛋白FISH實(shí)驗過(guò)程中我們設置一系列的質(zhì)控標準以確保每一步實(shí)驗的真實(shí)有效，如DNA片段PCR擴增跑膠圖、體外轉錄產(chǎn)物跑膠圖。具體示例如下圖所示：

探針跑膠圖，泳道一為探針體外轉錄模板DNA，泳道二為體外轉錄標記的RNA探針。

RNA-蛋白FISH示例：

上圖為RNA-蛋白FISH結果的一個(gè)示例，檢測的是LncRNA OLA1P2與磷酸化了的轉錄因子STAT3的關(guān)系，從上圖可看出兩者均位于細胞質(zhì)中并且出現的位置重合，說(shuō)明兩者之間有互作關(guān)系。

• 1 . 基因表達調控
  • 1.1. 表觀(guān)遺傳修飾調控
  • 1.2. 轉錄水平調控
  • 1.3. 轉錄后水平調控
• 2 . 基因表達調控實(shí)驗技術(shù)
  • 2.1. CHIP 染色質(zhì)免疫沉淀技術(shù)
  • 2.2. RIP RNA結合蛋白免疫沉淀技術(shù)
  • 2.3. CHIRP 免疫共沉淀實(shí)驗
  • 2.4. CLIP實(shí)驗技術(shù)
  • 2.5. RNA pull-down
  • 2.6. DNA pull-down
  • 2.7. RNA-RNA pull-down
  • 2.8. Luciferase 熒光素酶實(shí)驗
  • 2.9. DNA/RNA EMSA 凝膠電泳遷移實(shí)驗
  • 2.10. FISH 免疫熒光原位雜交技術(shù)
  • 2.11. ?核質(zhì)分離