Luciferase 熒光素酶實(shí)驗

啟動(dòng)子熒光素酶活性檢測

螢光素酶報告基因實(shí)驗（luciferase Assay）是檢測這類(lèi)轉錄因子和其靶啟動(dòng)子中的特異順序結合的重要手段，其原理簡(jiǎn)述如下：（1）用靶啟動(dòng)子的特定片段替換報告基因質(zhì)粒（如pGL3-basic）的啟動(dòng)子區。（2） 將要檢測的轉錄因子表達質(zhì)粒與報告基因質(zhì)粒共轉。如果該轉錄因子能夠激活靶啟動(dòng)子，則螢光素酶就會(huì )表達，且其表達量與轉錄因子的作用強度成正比。（3） 加入特定的底物，螢光素酶與底物反應，產(chǎn)生螢光素，檢測熒光的強度可以對螢光素酶的活性定量，進(jìn)而判斷該轉錄因子能否與靶啟動(dòng)子片段發(fā)生作用 （及其作用強度）。

Promoter活性Luciferase實(shí)驗常用載體——pGL3

3’-UTR活性檢測

由于miRNA主要通過(guò)作用于靶基因的3’UTR起作用，可以將目的基因3’UTR區域構建至載體中報告基因luciferase的后面， 通過(guò)比較過(guò)表達或者干擾miRNA后，報告基因表達的改變（監測螢光素酶的活性變化）可以定量反映miRNA對目的基因的抑制作用；結合定點(diǎn)突變等方法進(jìn)一步確定miRNA與靶基因3’UTR的作用位點(diǎn)。

miRNA靶基因Luciferase實(shí)驗常用載體——psiCHECK2

PCR擴增Luciferase點(diǎn)突變靶基因

在熒光素酶活性實(shí)驗過(guò)程中我們設置一系列的質(zhì)控標準以確保每一步實(shí)驗的真實(shí)有效，如目的基因啟動(dòng)子片段擴增跑膠圖、重組質(zhì)粒PCR驗證跑膠圖、測序，最后結果分析。具體示例如下圖所示（以啟動(dòng)子熒光素酶為例）：

目的基因啟動(dòng)子片段的PCR擴增

重組質(zhì)粒PCR驗證，證明目的基因片段插入到報告質(zhì)粒載體上。

啟動(dòng)子熒光素酶活性檢測結果示例，本實(shí)驗檢測的是轉錄因子與目的基因啟動(dòng)子的關(guān)系，從上圖結果我們可以看出轉錄因子對目的基因的啟動(dòng)子起作用促進(jìn)基因的表達，而目的基因啟動(dòng)子片段突變后基因的表達就不受轉錄因子的影響。

• 1 . 基因表達調控
  • 1.1. 表觀(guān)遺傳修飾調控
  • 1.2. 轉錄水平調控
  • 1.3. 轉錄后水平調控
• 2 . 基因表達調控實(shí)驗技術(shù)
  • 2.1. CHIP 染色質(zhì)免疫沉淀技術(shù)
  • 2.2. RIP RNA結合蛋白免疫沉淀技術(shù)
  • 2.3. CHIRP 免疫共沉淀實(shí)驗
  • 2.4. CLIP實(shí)驗技術(shù)
  • 2.5. RNA pull-down
  • 2.6. DNA pull-down
  • 2.7. RNA-RNA pull-down
  • 2.8. Luciferase 熒光素酶實(shí)驗
  • 2.9. DNA/RNA EMSA 凝膠電泳遷移實(shí)驗
  • 2.10. FISH 免疫熒光原位雜交技術(shù)
  • 2.11. ?核質(zhì)分離